血必凈通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路減輕大鼠睪丸缺血再灌注損傷*

施 源， 李宏軍， 王君君， 李 堅， 鄧新超， 魯 密， 張 輝

(武漢市第八醫院， 湖北 武漢 430010)

睪丸扭轉是泌尿外科中常見的臨床急癥之一，常為單側，主要表現為睪丸連同精索和附睪發生旋轉，精索內血流不暢導致睪丸缺血，睪丸內細胞凋亡等，最終易導致患者生殖能力受損或缺失，多發生于幼兒和青少年時期[1-2]。睪丸扭轉后出現缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是睪丸損傷的主要病理生理過程，其可使睪丸生殖細胞凋亡增加，最終導致睪丸萎縮和精子生發功能障礙[3-4]。因此，發生睪丸扭轉后盡早進行手術恢復睪丸血供并配合有效的藥物保護可減輕其損傷。血必凈(Xuebijing，XBJ)注射液是一種中藥復方靜脈制劑，其具有拮抗內毒素、抗炎癥、抗氧化以及改善微循環等多種功能[5-6]。已有研究表明，血必凈能減輕I/R損傷[7-8]。但血必凈對睪丸扭轉引起的I/R損傷的具體作用和相關機制還未見報道。因此，本研究旨在探討血必凈對大鼠睪丸扭轉復位I/R損傷的作用和相關機制，為臨床治療睪丸扭轉，減輕睪丸I/R損傷提供一定的理論依據。

材 料 和 方 法

1 實驗材料與試劑

健康雄性SD大鼠購自湖北省疾控中心(合格證號：No.42000600023890)，體質量(200±20)g。地塞米松(dexamethasone, Dex)購自Sigma；血必凈注射液購自天津紅日藥業股份有限公司；蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒購自碧云天生物技術公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和內皮素1(endothelin-1，ET-1)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗人p53多克隆抗體、兔抗人cyclin D1單克隆抗體、兔抗人cyclin依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2, CDK2)單克隆抗體、兔抗人cyclin B1單克隆抗體、兔抗人cleaved caspase-3多克隆抗體、兔抗小鼠Fas多克隆抗體、兔抗人FasL多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗大鼠PI3K單克隆抗體、兔抗人p-PI3K多克隆抗體、兔抗人AKT多克隆抗體、兔抗人p-AKT多克隆抗體、兔抗人mTOR多克隆抗體、兔抗人p-mTOR單克隆抗體、兔抗人S6K單克隆抗體和兔抗人p-S6K多克隆抗體均購自Abcam；兔抗人GAPDH多克隆抗體購自Proteintech；HRP標記的山羊抗兔IgG購自Bioswamp；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白質定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

2 主要方法

2.1動物模型建立與分組 45只大鼠隨機分為5組：對照(control)組、模型(I/R)組、血必凈低劑量(XBJ at low dose, XBJ-LD)組、血必凈高劑量(XBJ at high dose, XBJ-HD)組和地塞米松(Dex)組，每組9只。所有大鼠適應性飼養1周后進行動物實驗，除對照組大鼠外，其它4組大鼠均采用Turner法構建睪丸扭轉模型[9]，具體操作如下：采用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠仰臥位，固定四肢及頭部，采用常規備皮、乙醇消毒，取左側陰囊切口約3 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及肉膜，從切口擠出左側睪丸并游離，分離筋膜至附睪，結扎并切斷睪丸引帶，順時針扭轉睪丸720°，維持1 h后復位并于陰囊壁固定，關閉切口。低劑量和高劑量組大鼠在睪丸扭轉手術后分別按照0.5 mL·kg-1·d-1和2 mL·kg-1·d-1的劑量腹腔注射血必凈注射液；地塞米松組大鼠術后腹腔注射0.5 mL·kg-1·d-1地塞米松；每日給藥1次。對照組采用相同的方式切開陰囊皮膚，不進行睪丸扭轉，術后注射相同體積的生理鹽水。

2.2標本的采集 分別于給藥3、7、14 d后，每組隨機處死3只大鼠，取各組大鼠的左側睪丸組織，將所有睪丸標本沿中軸切開分兩部分，分別置于-80 ℃冰箱中保存。

2.3HE染色 將睪丸組織置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，常規石蠟包埋后連續切片，設定切片厚度為4 μm，水浴展片和高溫烤片后，通過常規脫蠟至水后進行HE染色，最后采用封片處理，光學顯微鏡后觀察各組大鼠睪丸組織的病理組織學變化。

2.4生化檢測 將收集的睪丸組織進行勻漿，3 000 r/min離心10 min，收集上清，分別采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，采用羥胺法測定SOD活性，采用硝酸還原酶法檢測NO含量，采用放射免疫分析法檢測ET-1含量，具體操作依據試劑盒說明書進行。

2.5Western blot實驗 將保存于-80 ℃的各組大鼠的睪丸采用RIPA裂解液提取組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣30 μL蛋白樣品，采用12%的SDS-PAGE進行凝膠電泳分離后，轉印至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉進行室溫封閉1 h，經TBST洗滌后分別加入一抗，4 ℃孵育過夜；TBST再次洗滌后，加入特異性 II 抗IgG，進行室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學發光試劑對其曝光顯影，拍照保存。每組實驗進行3次重復。

3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，實驗數據采用平均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

1 血必凈減輕I/R大鼠的睪丸損傷

各組大鼠睪丸組織的HE染色結果顯示，對照組睪丸曲細精管排列緊密，生殖細胞排列有序，結構層次清晰；I/R模型組睪丸曲細精管排列疏松，生殖細胞排列紊亂，細胞明顯減少、脫落；隨著作用時間的增加，XBJ低劑量組和高劑量組以及地塞米松組均可見生精細胞排列逐漸恢復正常，細胞層次逐漸清晰明了，少數腔內可見脫落細胞，其中高劑量組病理改善效果較低劑量更為顯著,見圖1。上述結果表明血必凈減輕I/R大鼠睪丸損傷的作用具有時間依賴性和劑量依賴性。

2 血必凈改變I/R大鼠睪丸中MDA、SOD、ET-1和NO的水平

生化檢測結果顯示,與對照組比較，I/R模型組大鼠睪丸組織中的SOD活性顯著降低，MDA、ET-1和NO的含量顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，血必凈低劑量組、高劑量組以及地塞米松組大鼠睪丸組織中的SOD含量明顯升高，MDA、ET-1和NO的含量降低(P<0.05),見表1、2。這些結果表明，血必凈可升高I/R大鼠睪丸組織中SOD活性，降低MDA、ET-1和NO含量，抑制I/R損傷組織中的氧化應激。

Figure 1. The pathological changes of the rat testis in each group (HE staining, ×200).

圖1 各組大鼠睪丸的病理變化觀察

表1 各組大鼠不同時點睪丸組織中MDA含量和SOD活性的比較

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;&P<0.05vsXBJ-LD group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d;■P<0.05vsthe same group at 7 d.

表2 各組大鼠不同時點睪丸組織中ET-1和NO含量的比較

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;&P<0.05vsXBJ-LD group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d;■P<0.05vsthe same group at 7 d.

3 血必凈對I/R損傷睪丸細胞周期相關蛋白的影響

同一時點，與對照組比較，I/R模型組大鼠睪丸組織中CDK2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E的表達水平顯著降低，p53的表達水平顯著升高；與I/R組比較，血必凈低劑量組、高劑量組以及地塞米松組大鼠睪丸組織中CDK2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E的表達水平顯著升高，p53的表達水平顯著降低，且血必凈高劑量組的效果更顯著。與第3天相比，血必凈低劑量組和高劑量組及地塞米松組第7天和14天大鼠的CDK2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E的表達水平顯著升高，p53的表達水平顯著降低，且呈時間依賴性(P<0.05),見圖2。

Figure 2. The expression of cell cycle-related proteins in the rat testicular tissues of each group detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group at 3 d;#P<0.05vsI/R group；▲P<0.05vsthe same group at 3 d.

圖2 Western blot檢測各組大鼠睪丸組織中細胞周期相關蛋白的表達

4 血必凈對I/R損傷睪丸凋亡相關蛋白的影響

同一時點，與對照組比較，I/R組大鼠睪丸組織中cleaved caspase-3、Bax、Fas和FasL的蛋白水平顯著升高，Bcl-2的表達水平顯著降低；與I/R模型組比較，血必凈低劑量組和高劑量組以及地塞米松組大鼠睪丸組織中cleaved caspase-3、Bax、Fas和FasL的蛋白水平顯著降低，Bcl-2的表達水平顯著升高，且血必凈高劑量組的效果更顯著(P<0.05),見圖3。與第3天相比，血必凈低劑量組和高劑量組及地塞米松組第7天和14天大鼠的cleaved caspase-3、Bax、Fas和FasL的蛋白水平顯著降低，Bcl-2的表達水平顯著升高，且呈時間依賴性。這些結果表明，血必凈能夠降低I/R大鼠睪丸生殖細胞的凋亡水平，其效應呈時間依賴性和劑量依賴性。

5 血必凈對I/R大鼠睪丸組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的影響

同一時點，與對照組比較，I/R模型組大鼠睪丸組織中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的蛋白水平顯著降低；與I/R組比較，血必凈低劑量組和高劑量組以及地塞米松組大鼠睪丸組織中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的蛋白水平顯著升高，且血必凈高劑量組的效果更顯著。與第3天相比，血必凈低劑量組和高劑量組及地塞米松組第7天和14天大鼠的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的蛋白水平顯著升高，其效應呈時間依賴性(P<0.05)，見圖4。

Figure 3. The protein levels of apoptosis-related molecules in the rat testicular tissues of each group detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group at 3 d;#P<0.05vsI/R group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d.

圖3 Western blot檢測各組大鼠睪丸組織中凋亡相關蛋白水平的變化

Figure 4. The protien levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related molecules in the rat testicular tissues of each group detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group at 3 d;#P<0.05vsI/R group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d.

圖4 Western blot檢測各組大鼠睪丸組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白水平的變化

討 論

發生睪丸扭轉后應及時進行復位手術以恢復睪丸供血，避免患者因睪丸損傷或壞死而影響生育能力[10]。然而臨床和基礎研究均顯示睪丸扭轉復位也是一種I/R過程，睪丸缺血恢復供氧后可引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)過度生成，同時產生高濃度的活性氮基團，導致細胞凋亡增加，引起睪丸損傷以及生精功能障礙。血必凈是在中醫中藥理論的指導下由多種傳統中草藥研制而成的，主要包含紅花、當歸、川穹、丹參以及赤芍等，具有活血化瘀、抗炎、抗氧化、增強免疫力、清熱解毒等作用[7-8]，對膿毒癥、重度肺炎、全身炎癥反應綜合征以及I/R損傷等均具有一定的治療作用[10-13]。本研究構建大鼠睪丸扭轉復位模型，結果表明血必凈可明顯減輕大鼠睪丸扭轉復位的I/R損傷，且其作用具有時間依賴性和劑量依賴性。

ROS通過攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用而產生MDA，且過量的活性氧可以氧化脂質、細胞膜蛋白和DNA，導致一系列細胞功能障礙或凋亡，進一步加劇缺血性睪丸的組織損傷[14-15]。SOD參與細胞生長分化，其可通過催化超氧自由基發生歧化反應來避免細胞受損，其抗氧化能力可有效減輕睪丸I/R損傷[16-17]。武志剛等[18]的研究表明他達拉非可明顯減輕大鼠睪丸扭轉復位的I/R損傷，顯著升高I/R大鼠睪丸組織的SOD水平，而顯著降低MDA水平。ET-1/NO是一對血管活性物質，共同參與調節血管張力。ET是一種強效的縮血管物質，主要由血管內皮細胞合成分泌，廣泛分布于神經系統中，生理狀態下，低濃度的ET-1可選擇性地激動ETB受體，擴張睪丸血管，參與調節睪丸血流。睪丸缺血再灌注后，局部組織高濃度的ET-1使血管發生強烈、長時間的收縮，從而加重局部缺血反應[19]。NO參與調節多種生理病理過程，對各種生殖活動起重要作用，低濃度NO可刺激睪酮分泌，過量的NO可導致生精功能障礙而引起不育[20]。本研究結果表明血必凈可升高I/R大鼠睪丸組織中SOD活性，降低MDA、ET-1和NO含量，抑制I/R損傷組織中的氧化應激。

細胞凋亡在維持精子發生的動態平衡中具有重要作用，睪丸扭轉復位I/R可促進同側睪丸細胞凋亡的發生，且凋亡的程度與缺血時間有關[21]。促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2是一對關系密切的凋亡相關基因，caspase-3是介導細胞凋亡的關鍵效應分子，其對細胞凋亡的調控具有重要作用[22]。PI3K/Akt/mTOR信號通路參與了細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程，并與ROS介導的信號傳導密切相關，當細胞出現氧化應激損傷時，可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路保護細胞[23-25]。研究發現，PI3K/Akt/mTOR通路激活后可抑制肝臟氧化應激反應，從而減緩肝臟IR后的細胞凋亡[26]。PI3K/Akt/mTOR信號通路可調控睪丸組織發育、精原干細胞增殖分化以及精子發生等過程，通過抑制mTORC1通路可誘導未分化精原細胞在生精小管內累積并阻斷精原細胞分化[27]。本研究結果表明血必凈能夠通過介導細胞周期和細胞凋亡相關因子的表達，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路來明顯減輕睪丸扭轉大鼠的I/R損傷睪丸組織的病理損傷，且其作用效果呈劑量依賴性和時間依賴性。

綜上所述，本研究表明血必凈可有效減輕大鼠睪丸缺血再灌注后睪丸的病理損傷，降低大鼠睪丸組織的氧化應激反應損傷，其作用機制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路來實現的，且血必凈的作用效果呈劑量依賴性和時間依賴性。本研究結果將為臨床應用血必凈治療睪丸扭轉，減輕患者的睪丸損傷提供一定的理論依據。