基于ILK信號(hào)通路探究馬桑水提取物影響大鼠燒傷創(chuàng)面愈合和瘢痕增生的機(jī)制*

李相國(guó)， 杜萬雪， 徐婭麗， 黃德斌， 胡澤華

(湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 湖北 恩施 445000)

馬桑(CoriariasinicaMaxim)的主要成分為馬桑內(nèi)酯(coriria lactone)、馬桑亭(coriatin)和羥基馬桑毒素(tutin)，還含有槲皮素、山柰酚、谷甾醇及多種無機(jī)元素等。民間外用馬桑水提取物(CoriariasinicaMaxim’s extract，CSME)治療燒傷和經(jīng)久不愈的創(chuàng)面等。本課題組研究證實(shí)，CSME能促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的修復(fù)，同時(shí)抑制其病理性瘢痕的過度增生[1]。為進(jìn)一步探究其機(jī)制，本研究以CSME為干預(yù)藥物，探究其對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導(dǎo)整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)活性而增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分表達(dá)的調(diào)控效應(yīng)，證實(shí)其機(jī)制與其多成分多靶點(diǎn)影響ILK和PI3K/AKT調(diào)控的信號(hào)通路有關(guān)。現(xiàn)報(bào)告如下。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1馬桑水提取物的制備 參照文獻(xiàn)[1]，9月采集兩年生鮮原生紅馬桑植物枝條，經(jīng)植物學(xué)鑒定后晾干粉碎備用。稱取馬桑干粉1 kg，浸泡30 min(1 000 mL蒸餾水)，每次煎煮90 min，共提取3次，將所得提取物合并、過濾，并用水浴鍋濃縮成CSME浸膏(100%，1 mL相當(dāng)于10 g生藥)備用[1]。使用時(shí)，將其與醫(yī)用凡士林混合成外用燒傷軟膏(分別按1∶19、1∶9和1∶4的比例配成低、中和高劑量，相當(dāng)于含生藥量5%、10%和20%)。

1.2儀器與試劑 YLS-5Q臺(tái)式超級(jí)控溫燙傷儀(天津科技發(fā)展有限公司)。抗整合素β1(integrin-β1, ITG-β1)抗體(上海微蒙生物科技有限公司)；抗ILK單克隆抗體和抗鼠尾 I/III型膠原(collagen type I/III, Col I/III)抗體(Santa Cruz)；DAB顯色試劑盒、SP和SABC試劑盒(江蘇綠葉生物科技有限公司)；多聚甲醛、EDTA和TRIzol Reagent(上海哈靈生物科技有限公司);羊抗兔TGF-β1和兔抗人ILK單克隆抗體(Sigma)；抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(PolyPlus-Transfection);磺胺嘧啶銀(silver sulfadiazine，SS)乳膏(1%：25 g，國(guó)藥準(zhǔn)字H20057720，昆明華潤(rùn)圣火藥業(yè)有限公司)。相關(guān)引物由武漢巴菲爾生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

F: forward; R: reverse; FN: fibronectin.

2 方法

2.1動(dòng)物分組、模型建立及創(chuàng)面愈合率(healing rate，HR)計(jì)算 SPF級(jí)6周齡SD雌性大鼠180只(180～200 g)，購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(No.42010200000304)。所有動(dòng)物處理嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南，在學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下自由飲食適應(yīng)1周[溫度(24±3)℃，濕度(50±5)%]后，隨機(jī)選取30只作為正常對(duì)照(normal control，NC)組，其余150只作為實(shí)驗(yàn)組，禁食12 h后，用水合氯醛麻醉(10%，3 mL/kg，i.p.)，以腰背部為中心，逐一進(jìn)行剪毛(3 cm×3 cm)、脫毛(8% Na2S)、沖洗(溫水)、消毒(75%乙醇)、燙傷(探頭2.5 cm×2.5 cm，壓力500 g，時(shí)間20 s)，形成 II° 燙傷模型[1-2]，之后隨機(jī)將模型動(dòng)物再分成陰性對(duì)照(凡士林，vaseline，VL)組、陽性對(duì)照(磺胺嘧啶銀，SS)組以及CSME低、中和高劑量(low-dose CSME、 middle-dose CSME和high-dose CSME, CSME-L、 CSME-M和CSME-H)組，每組30只[1]。術(shù)后創(chuàng)面分別涂擦凡士林、磺胺嘧啶銀和3種劑量的CSME燒傷軟膏，腹腔注射乳酸林格氏液5 mL抗休克3 d。每天換藥1次(各軟膏涂擦量為2.0 g)直至創(chuàng)面愈合[2]。在3 d、7 d、14 d和21 d記錄創(chuàng)面情況，透明膜描記法計(jì)算HR，數(shù)據(jù)用Image-Pro Plus結(jié)合Excel 2000處理，其計(jì)算公式為：HR(%)=(PA-NHA)/PA×100%[1][PA(primordial area)：原始創(chuàng)面面積;NHA(non-healing area)：未愈創(chuàng)面面積]。創(chuàng)面完全愈合的標(biāo)準(zhǔn)為：創(chuàng)面完全被上皮覆蓋，無殘余缺損，創(chuàng)面色均一而光滑[2]。

2.2皮膚標(biāo)本采集與處理 各組于第7、14和21天分別隨機(jī)選取10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)，切取背部創(chuàng)面全層皮膚分成兩部分(NC組切取相應(yīng)部位皮膚)，一部分置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫硪徊糠忠?0%的甲醛溶液固定，備用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

2.3HE染色與免疫組織化學(xué)染色分析 HE染色: 先以多聚甲醛固定2 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片(厚5 μm)行HE染色，并在鏡下觀察[3-4]。免疫組織化學(xué)染色：石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2孵育10 min(25 ℃)，加入0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(sodium citrate buffer，SCB)后，用微波(80 ℃，15 min)進(jìn)行抗原修復(fù)，加入非免疫血清孵育20 min(25 ℃)，再加入兔抗鼠ILK單克隆抗體(1∶100)100 μL(陰性對(duì)照以SPB為 I 抗)；于冰箱保存24 h(4 ℃)后，按1∶100加入100 μL山羊抗兔IgG(生物素標(biāo)記)水浴鍋37 ℃孵育10 min，加鏈霉抗生物素-過氧化物酶孵育10 min(37℃)，經(jīng)過5～10 min的DAB顯色，再以蘇木素進(jìn)行復(fù)染后，經(jīng)脫水、透明、封片等一系列處理，完成SP法免疫組織化學(xué)染色。

2.4Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 分別取各組全層創(chuàng)面皮膚組織(去痂)，于4 ℃ 生理鹽水漂洗3次，濾紙拭干，稱取500 mg于冰浴中剪碎，置入勻漿器，按每1 mg 組織加1 mL蛋白提取液勻漿200次(4 ℃)，轉(zhuǎn)入離心管低溫離心10 min(4 ℃，3 000 r/min)，取上清置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｒ訵estern blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.5RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)mRNA的表達(dá) 將標(biāo)本勻漿，置入EP管(1.5 mL)，滴入TRIzol液1 mL吹打后再滴入0.2 mL氯仿振蕩15 s，25 ℃孵育3 min后離心(4 ℃，15 min，12 000 r/min)，取上清置入新EP管，滴入異丙醇(與上清等體積)，孵育10 min后離心，棄上清。以75% DEPC乙醇洗滌沉淀，離心5 min棄上清干燥(25 ℃)，以DEPC處理總RNA。RT-PCR總反應(yīng)體積為20 μL，PCR儀中反應(yīng)1 h(37 ℃)后RT反應(yīng)3 min(95 ℃)。其體系構(gòu)成為：DEPC 10.1 μL，dNTPs 0.5 μL(10 mmol/L)，MMLV 1 μL(2×108U/L)，RNA模板4 μL，下游引物0.4 μL，5×RT buffer 4 μL(pH 8.0，50 mmol/L KCl和Tris-HCl，10 mmol/L DTT，4 mmol/L MgCl2)。熒光定量PCR總反應(yīng)體積為50 μL，熒光定量PCR儀中93 ℃反應(yīng)3 min后，分別在溫度93 ℃、55 ℃、72 ℃條件下反應(yīng)30 s、45 s和45 s， 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。其體系構(gòu)成為：cDNA 5 μL，Taq酶1 μL(3×106U/L)，dNTPs 1 μL(10 mmol/L)，ddH2O 31 μL，上游引物1 μL(10 pmol/L)，下游引物1 μL(10 pmol/L)，5×SYBR Green I buffer 10 μL(pH 8.0， 50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgCl2)。

2.6成纖維細(xì)胞(fibroblasts, FB)膠原收縮率(shrinkage，SK)的測(cè)定 按文獻(xiàn)[4-5]，選擇NC組腰背部正常皮膚標(biāo)本，去表皮，切成小塊組織(1 mm×1 mm×1 mm)，將其接種于培養(yǎng)瓶底部培養(yǎng)1 周，當(dāng)大量成纖維細(xì)胞(鏡下為梭形)游離出并完全覆蓋瓶底時(shí)，用胰酶(0.5%)和EDTA(0.04%)消化傳代。取4～6代原代細(xì)胞接種(每孔2×104)24 h后，將其分為5組，分別于冰上加2 mL混懸液于35 mm的6孔培養(yǎng)板，恒溫箱孵育10 min(37 ℃)形成凝膠狀，再加DMEM培養(yǎng)液，以細(xì)針頭輕柔吹打使之懸浮后，培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h(5% CO2，37 ℃)后分成6組，分別加入含NS及上述濃度VL、SS和CSME的DMEM培養(yǎng)液，分別于24 h、48 h、72 h和96 h以多聚甲醛(4%)固定冰箱保存?zhèn)溆?-20 ℃)，在坐標(biāo)紙上攝片，測(cè)定起始面積(initial area，IA)和最終面積(final area，F(xiàn)A)，以Image-Pro Plus軟件分析。計(jì)算公式為：SK(%)=(IA-FA)/IA×100%

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理使用SPSS 12.0軟件。全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較，先分析方差齊性，再進(jìn)行方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 創(chuàng)面愈合情況

第1～3天，除了第3天時(shí)少數(shù)CSME組創(chuàng)面中央顏色明顯暗紅外，其它情況(包括HR值)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。第7天時(shí)，VL組創(chuàng)面滲出明顯，結(jié)痂為暗紅色，而SS和CSME各組的創(chuàng)面干燥，幾乎無滲出液，結(jié)痂為褐色，且CSME組中部分創(chuàng)緣呈現(xiàn)脫痂趨勢(shì)，各組之間HR值仍無明顯差異(P>0.05)。第14天時(shí)，所有動(dòng)物創(chuàng)面均已干燥，創(chuàng)面面積明顯縮小，結(jié)痂為褐色或黑色，其中VL組的創(chuàng)面滲液明顯，無明顯脫痂趨勢(shì)，新生上皮活躍性差，新生被毛未見；SS組的創(chuàng)面滲液少許，創(chuàng)緣脫痂明顯，新生上皮活躍，新生被毛少見，HR值顯著高于VL組(P<0.05)；CSME各組創(chuàng)面滲液罕見，創(chuàng)緣脫痂明顯，新生上皮高度活躍，新生被毛多見，HR值顯著高于SS組(P<0.05)，且呈劑量依賴趨勢(shì)。至第21天時(shí)，VL組的創(chuàng)面大部分被新生上皮覆蓋，被毛生長(zhǎng)多見，但創(chuàng)面中央黑色結(jié)痂仍未完全脫落[未愈合面積為(0.45±0.02)cm]；SS組與CSME各組創(chuàng)面的HR較VL組顯著升高(P<0.05)，其中，SS組的創(chuàng)面可見稀疏、細(xì)小而無光澤的新生被毛，而CSME各組創(chuàng)面的被毛密集，幾乎全部被被毛覆蓋，皮膚趨于正常，且呈劑量依賴性。見圖1。

Figure 1. The effects of CSME on wound healing of burn wounds in the rats with different treatments. A: the images of the healing of burn wounds in the rats; B: the quantitative analysis of the burn wounds in rats expressed as the changes of HR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsVL group;△P<0.05vsSS group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group.

圖1 CSME對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面愈合的影響

2 創(chuàng)面組織學(xué)觀察結(jié)果

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，各組創(chuàng)面均未見明顯感染征象，所有動(dòng)物均順利完成觀察。

第7天，VL組與SS組的創(chuàng)面壞死組織出現(xiàn)脫離趨勢(shì)，組織細(xì)胞大量變性壞死，細(xì)胞漿廣泛濃縮甚至消失，細(xì)胞核大量固縮；中央表皮細(xì)胞未見，無明顯組織生長(zhǎng)；真皮層明顯充血水腫，纖維中炎癥細(xì)胞大量廣泛浸潤(rùn)；膠原纖維腫脹明顯，原纖維結(jié)構(gòu)基本消失，大多數(shù)出現(xiàn)融合。CSME各組創(chuàng)面壞死組織呈劑量依賴性出現(xiàn)明顯脫落、部分脫落和大部分脫離，且細(xì)胞變化、炎癥變化以及膠原纖維變化也呈劑量依賴性優(yōu)于SS組和VL組。

第14天，VL組的創(chuàng)緣壞死組織小范圍溶脫，創(chuàng)緣表皮細(xì)胞零散覆蓋，少量肉芽組織露出，可見上皮組織生長(zhǎng)，多個(gè)皮島形成；輕度真皮層充血水腫，纖維中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少許；部分膠原纖維腫脹，少數(shù)出現(xiàn)融合，原纖維結(jié)構(gòu)基本完整；組織細(xì)胞仍有部分變性壞死，部分細(xì)胞漿濃縮，少數(shù)細(xì)胞核固縮。SS組的創(chuàng)緣壞死組織部分溶脫，創(chuàng)緣表皮細(xì)胞成片覆蓋，部分肉芽組織露出，上皮組織生長(zhǎng)旺盛，皮島形成多(與VL組相當(dāng))；真皮層充血水腫不明顯，少見纖維中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；少數(shù)膠原纖維腫脹和融合，原纖維結(jié)構(gòu)基本完整；少許組織細(xì)胞變性壞死，少數(shù)細(xì)胞漿濃縮，少見細(xì)胞核固縮。CSME各組皮島呈劑量依賴性大量形成，甚至連接成片完全覆蓋，其它細(xì)胞變化、炎癥變化以及膠原纖維變化也呈劑量依賴性優(yōu)于SS組和VL組。

第21天，VL組多數(shù)創(chuàng)面趨于愈合，但創(chuàng)面中央組織結(jié)構(gòu)完整度差，上皮細(xì)胞分化不滿意，仍有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。SS組多數(shù)創(chuàng)面完全愈合，中央?yún)^(qū)域單層上皮細(xì)胞覆蓋良好，可見不規(guī)則排列的膠原纖維，組織結(jié)構(gòu)部分完整，可見少數(shù)新生皮脂腺和毛囊。CSME各組呈劑量依賴性創(chuàng)面多層上皮細(xì)胞覆蓋，新生膠原纖維分化度增強(qiáng)，排列整齊，基本具備正常皮膚組織結(jié)構(gòu)，皮脂腺和毛囊增生高度活躍，呈劑量依賴性優(yōu)于SS組和VL組，見圖2。

Figure 2. The effects of CSME on pathological change of burn wounds in the rats (HE staining, ×200). The arrows refer to fiber swelling and cell changes in the figure.

圖2 CSME對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面病理變化的影響

3 CSME對(duì)創(chuàng)面組織中ILK和ITG-β1蛋白表達(dá)的影響

VL組與SS組的創(chuàng)面組織中ILK和ITG-β1蛋白表達(dá)水平的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，在第7、14和21天愈合過程中，隨時(shí)間的推移，創(chuàng)面組織中的ILK和ITG-β1表達(dá)均顯著強(qiáng)于正常皮膚(P<0.05)；CSME各組在第7天呈現(xiàn)劑量依賴性強(qiáng)于VL組和SS組(P<0.05)，第7天達(dá)最高峰，第14天與VL組和SS組相當(dāng)，開始呈劑量依賴性下降(P>0.05)，而在第21天顯著弱于VL組和SS組(P<0.05)，與NC組相當(dāng)，見圖3。免疫組化結(jié)果也顯示，第21天時(shí)，創(chuàng)面組織中的ILK在新生表皮細(xì)胞、毛囊周圍以及部分FB胞漿中陽性染色為黃色，NC組的染色不明顯，VL組與SS組相當(dāng)，明顯強(qiáng)于CSME各組，CSME各組呈劑量依賴性減弱趨勢(shì)，見圖4。

Figure 3. The results of Western blot for determining the effects of CSME on the protein expression of ILK and ITG-β1in the burn wound tissues of the rats. Mean±SD.n=3.△P<0.05vsVL and SS group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group;*P<0.05vsNC group.

圖3 Western blot 檢測(cè)CSME對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面組織中ILK和 ITG-β1蛋白表達(dá)的影響

Figure 4. The images of histoimmunochemical staining for observing the effects of CSME on the protein expression of ILK in the burn wound tissues of the rats at 21st day (light yellow， ×200).

圖4 免疫組織化學(xué)染色分析CSME對(duì)創(chuàng)面組織中ILK表達(dá)的影響

4 CSME對(duì)創(chuàng)面組織中相關(guān)分子 mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，VL組與SS組創(chuàng)面組織中ILK、ITG-β1、FN和TGF-β1mRNA的表達(dá)隨時(shí)間的推移而持續(xù)增加，2組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；第7天，CSME各組創(chuàng)面組織中ILK、ITG-β1、FN和TGF-β1的mRNA表達(dá)呈劑量依賴性明顯高于VL組和SS組，而第21天卻低于VL組和SS組(P<0.05),見圖5。

5 CSME對(duì)成纖維細(xì)胞膠原SK的影響

NC組未發(fā)現(xiàn)FB膠原凝膠收縮。隨時(shí)間的推移，VL組和SS組的收縮率逐漸升高，其中在24 h、48 h和72 h，SS組與CSME-L組相當(dāng)(P>0.05)，均顯著高于VL組(P<0.05)；在24 h和48 h，CSME-M組SK顯著高于SS組和CSME-L組，而低于CSME-H組(P<0.05)；在96 h，CSME各組呈劑量依賴性低于VL組和SS組(P<0.05)，表明CSME早期促進(jìn)創(chuàng)面收縮，后期抑制創(chuàng)面收縮，其機(jī)制與調(diào)控FB膠原凝膠收縮有關(guān)，見表2。

Figure 5. The effects of CSME on the mRNA expression of ILK, ITG-β1, FN and TGF-β1in the burn wound tissues of the rats at 21st day. Mean±SD.n=10.△P<0.05vsVL and SS group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group;*P<0.05vsNC group.

圖5 CSME對(duì)創(chuàng)面組織中ILK、ITG-β1、FN和TGF-β1mRNA表達(dá)的影響

表2 CSME對(duì)大鼠皮膚組織成纖維細(xì)胞膠原SK的影響

*P<0.05vsNC group;△P<0.05vsVL group;#P<0.05vsSS group and CSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group.

6 CSME對(duì)創(chuàng)面組織中α-SMA蛋白表達(dá)的影響

正常皮膚各組間α-SMA蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；隨時(shí)間的推移，VL組和SS組α-SMA蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，第7天以后，SS組顯著低于VL組(P<0.05)；第7天，CSME-M組和CSME-H組呈劑量依賴性強(qiáng)于VL組和SS組，而第14天和21天呈劑量依賴性弱于VL組和SS組(P<0.05),表明CSME早期促進(jìn)創(chuàng)面α-SMA蛋白表達(dá)，后期抑制其表達(dá)，見圖6。

7 CSME對(duì)Col I和Col III蛋白與mRNA表達(dá)的影響

對(duì)于Col I蛋白與mRNA表達(dá)來說，各個(gè)時(shí)點(diǎn)VL組和SS組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，并隨時(shí)間的推移而持續(xù)升高；第14天，CSME各組呈劑量依賴性高于VL組和SS組，而21 d則低于VL組和SS組(P<0.05)。對(duì)于Col III蛋白與mRNA表達(dá)來說，其結(jié)果恰與上述相反。這表明CSME早期呈劑量依賴性促進(jìn)創(chuàng)面Col I蛋白與mRNA表達(dá)，抑制Col III 蛋白與mRNA表達(dá)，后期則相反，見圖7。

Figure 6. The results of Western blot for determining the effects of CSME on the protein expression of α-SMA in the burn wound tissues of the rats at 21st day. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNC group;△P<0.05vsVL group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M.

圖6 Western blot 檢測(cè)CSME對(duì)創(chuàng)面組織中α-SMA蛋白表達(dá)的影響

討 論

創(chuàng)面修復(fù)是表皮再生與真皮重構(gòu)的過程,首先在殘留基底層、汗腺與毛囊等處，表皮干細(xì)胞(epidermal stem cell，ESC)增生、分化成表皮細(xì)胞(epidermal cell，EC)而完成表皮再生;隨后FB大量增生并分泌膠原形成ECM而完成真皮重構(gòu)。ITG是一類介導(dǎo)細(xì)胞黏附、ECM和創(chuàng)面細(xì)胞信號(hào)傳遞而調(diào)控細(xì)胞遷移、分化、增生及凋亡的細(xì)胞表面分子，可通過FB調(diào)節(jié)膠原網(wǎng)架收縮介導(dǎo)創(chuàng)面收縮而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[6]。若深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面未殘有真皮、毛囊、汗腺和皮脂腺等附件，創(chuàng)面不能增殖成上皮島，則創(chuàng)面修復(fù)慢，瘢痕多，甚至攣縮為畸形[7]。

ITG-β1的高表達(dá)能促進(jìn)ESC增生，并保持ESC的特性，ITG-β1低表達(dá)時(shí)ESC分化成角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，IKC)的速度加快[8]。有報(bào)道顯示，創(chuàng)面愈合中ILK與ITG-β1高度表達(dá)[9]，說明ILK是調(diào)控ITG-β1信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶，與燒傷創(chuàng)面的早期愈合和后期瘢痕形成有關(guān)聯(lián)。ILK還可被細(xì)胞生長(zhǎng)因子(growth factor，GF)受體胞內(nèi)信號(hào)通路的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)激活，一方面，激活PKB/Akt通路而抑制細(xì)胞凋亡和加快細(xì)胞增生；另一方面，抑制GSK-3β磷酸化，使β-catenin降解減少而進(jìn)入細(xì)胞核激活轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef，促進(jìn)ECM轉(zhuǎn)錄而加快組織器官的纖維化[10-11]。研究證實(shí)，TGF-β1信號(hào)通路與ITG-β1存在互通現(xiàn)象，調(diào)控著創(chuàng)面愈合后期癱痕的形成[12-13],這種互通可能是ITG-β1信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶ILK通過其N-端重復(fù)序列與PINCH的LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的[8, 13]。本研究顯示，第7和14天，CSME各組相關(guān)mRNA表達(dá)呈劑量依賴性高表達(dá)，而第21天呈劑量依賴性低表達(dá)。表明創(chuàng)面愈合早期與ILK、ITG-β1和TGF-β1高表達(dá)相關(guān)，這些高表達(dá)介導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞黏附、ECM和創(chuàng)面細(xì)胞信號(hào)傳遞，促進(jìn)ESC增生和皮膚組織纖維化，加快創(chuàng)面愈合；而在后期修復(fù)中，ILK、ITG-β1和TGF-β1呈現(xiàn)低表達(dá)，有利于ESC分化成IKC，限制瘢痕的過度增生，提示CSME促進(jìn)大鼠燒傷創(chuàng)面早期愈合和抑制創(chuàng)面后期瘢痕過度增生的機(jī)制與干預(yù)ILK調(diào)控的ITG-β1和互通的TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)。

適度的創(chuàng)面收縮能有效減少創(chuàng)面面積，縮短愈合時(shí)間；而過度的創(chuàng)面收縮會(huì)導(dǎo)致瘢痕攣縮和牽拉，影響皮膚外觀和器官功能。“相框”理論認(rèn)為，創(chuàng)緣細(xì)胞向中央遷移，通過ECM帶動(dòng)創(chuàng)面縮小；“牽拉”理論認(rèn)為，創(chuàng)面中間細(xì)胞收縮牽拉ECM而收縮[9,13]，兩假說的共同點(diǎn)是FB與ECM的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面肉芽組織中存在可特異性表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，mFB)，具有平滑肌和FB雙重特征，是創(chuàng)面收縮的主要?jiǎng)恿7，13]。作為ITG-β1信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶ILK，其催化結(jié)構(gòu)域C-端作用于并調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白α/β-parvin的組裝與收縮[2-3]。同時(shí)，還通過啟動(dòng)信號(hào)通路PI3K/AKT激活I(lǐng)LK而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移與收縮[8,11]。創(chuàng)面修復(fù)的早期，ILK隨PI3K/AKT的啟動(dòng)而活化。本研究證實(shí)，第7天后，VL組和SS組的α-SMA蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)，第7天，CSME呈劑量依賴性強(qiáng)于VL組和SS組，而第14和21天呈劑量依賴性弱于VL組和SS組(P<0.05),與組織學(xué)觀察的肉芽組織成熟度強(qiáng)于VL組和SS組一致。表明CSME早期促進(jìn)創(chuàng)面α-SMA蛋白表達(dá)，加速創(chuàng)面愈合，后期抑制其表達(dá)，防止創(chuàng)面過度收縮，減輕瘢痕形成和攣縮畸形，提示CSME是通過調(diào)控ILK活性而影響含成纖維細(xì)胞的膠原網(wǎng)架(fibroblast-populated collagen lattice, FPCL)收縮的，表明CSME中存在抑制PI3K/AKT通路的某種小分子物質(zhì)，在創(chuàng)面修復(fù)后期特異性抑制此通路而干預(yù)ILK互通信號(hào)的傳導(dǎo)。

Figure 7. Effects of CSME on the protein and mRNA exprission of Col I and Col III in the burn wound tissues of the rats at 21st day. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNC group;△P<0.05vsVL and SS group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group.

圖7 CSME對(duì)創(chuàng)面組織中Col I和Col III蛋白與mRNA表達(dá)的影響

真皮的主要成分是ECM，其抗?fàn)坷途S持彈性的細(xì)胞支架是Col I和Col III,粗大的Col I為創(chuàng)面瘢痕組織的物質(zhì)基礎(chǔ)，細(xì)小的Col Ⅲ位于真皮深層[6, 9]。在無瘢痕愈合組織中Col I很少，而Col Ⅲ含量很高[9. 11]，說明其含量比與瘢痕程度相關(guān)。ECM通過ITG-β1通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡及細(xì)胞骨架蛋白的組裝。創(chuàng)面愈合的早期需要大量ECM的沉積，若后期ECM的過多沉積可致癱痕過度增生。ECM可通過FN激動(dòng)ITG-β1受體而激活其信號(hào)通路，提高細(xì)胞對(duì)GF的反應(yīng)性，并增強(qiáng)GF的表達(dá)，TGF-β1等反過來又加快ECM的表達(dá)[2]。GSK-3β可被ILK抑制而阻止β-catenin的降解，使之進(jìn)入細(xì)胞核增多，激活Tcf/Lef而調(diào)控FN合成，促進(jìn)Col I和Col III的表達(dá)，提示Col I蛋白與mRNA表達(dá)隨時(shí)間的推移而持續(xù)升高；第14天，CSME各組呈劑量依賴性高于VL組和SS組，而21 d則低于VL組和SS組(P<0.05)，而Col III蛋白與mRNA表達(dá)結(jié)果恰與上述相反，說明CSME早期呈劑量依賴性促進(jìn)創(chuàng)面Col I 蛋白與mRNA表達(dá)，抑制Col III 蛋白與mRNA表達(dá)，后期則相反，表明CSME在增強(qiáng)創(chuàng)面愈合早期Col I表達(dá)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，后期促進(jìn)Col III表達(dá)而抑制瘢痕形成中具有重要作用。提示CSME在促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合的同時(shí)，通過ColⅠ與Col III表達(dá)比的調(diào)控而減輕瘢痕過度增生。

總之，大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率和組織學(xué)觀察均顯示，CSME能促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合的同時(shí)，抑制創(chuàng)面瘢痕的過度增生。由于燒傷創(chuàng)面的早期愈合和后期瘢痕的過度增生與ITG-β1信號(hào)通路密切相關(guān)，提示CSME促進(jìn)大鼠燒傷創(chuàng)面早期愈合和抑制創(chuàng)面后期瘢痕過度增生的機(jī)制與干預(yù)ILK調(diào)控的ITG-β1與TGF-β1信號(hào)通路、影響PI3K/AKT調(diào)節(jié)的ILK互通信號(hào)傳導(dǎo)及ColⅠ與Col III表達(dá)比的調(diào)控相關(guān),我們認(rèn)為，其機(jī)制可能與其多成分多靶點(diǎn)效應(yīng)分別影響ILK調(diào)控的ITG-β1和TGF-β1信號(hào)通路、PI3K/AKT調(diào)控的ILK信號(hào)通路及ColⅠ與Col III表達(dá)比相關(guān)。由于創(chuàng)面早期愈合和后期瘢痕過度增生的機(jī)制很復(fù)雜，且目前的相關(guān)學(xué)說與理論較多，沒有基本一致的定論。因此，要研究CSME早期促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合和后期抑制創(chuàng)面瘢痕過度增生的機(jī)制，我們認(rèn)為進(jìn)一步探究創(chuàng)面早期愈合和后期瘢痕過度增生的機(jī)制將是未來的重要研究方向。