IL-1、IL-10及TNF-β單核苷酸多態(tài)性與福建泉州地區(qū)漢族人群類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究*

張淑花， 楊會勇， 鄭晨娜， 蔡志謀， 沈曉麗

(1福建省泉州市鯉城區(qū)江南街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗科, 2華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 3福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 泉州 362000; 4福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院,福建省心血管病重點實驗室， 福建 福州 350001)

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種自身免疫性疾病，其在我國的發(fā)病率約為0.4%[1]。RA免疫發(fā)病機制主要涉及多種免疫細胞及免疫分子之間的相互影響和相互作用[2]，從本質(zhì)上來說，RA的發(fā)生是由于體內(nèi)免疫機制平衡被打破，從而導(dǎo)致一些炎癥細胞因子如白細胞介素1(interlenkin-1, IL-1)、IL-10和腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor β, TNF-β)等的比例失衡。如果能夠從分子生物學(xué)和遺傳學(xué)角度進一步了解RA的發(fā)病機制，那將為RA等非可控炎癥精準治療方案的制定和特效藥物的研制提供支持。

目前研究認為，單核苷酸多態(tài)性(single nudeotide polymorphism,SNP)多與復(fù)雜性疾病發(fā)病有很大相關(guān)性[3-4]，其中遺傳與環(huán)境因素是RA發(fā)生的主要原因，在不同地區(qū)的人群之間具有遺傳差異性[5]。本研究以福建泉州地區(qū)漢族人群為研究對象，探討IL-1β、IL-10及TNF-β等炎癥相關(guān)因子5個SNP位點的分布特征，研究其與RA易感性的關(guān)系。由于當(dāng)前研究多數(shù)關(guān)注單個SNP位點對RA發(fā)病的影響及相關(guān)分子機制[6]，鑒于炎癥相關(guān)因子多SNP位點可能存在著相互影響，本研究對RA炎癥相關(guān)因子的多SNP位點進行連鎖不平衡與單倍型聯(lián)合分析，為RA的分子生物學(xué)發(fā)病機制及福建泉州地區(qū)漢族人群RA的基因遺傳背景提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 研究對象

RA組：自2014年6月～2016年6月期間，在福建泉州地區(qū)漢族人群中，于泉州正骨醫(yī)院和江南醫(yī)院門診或住院部抽取155 例(女性107例，男性48例)、平均年齡(50.3±10.8)歲的RA患者(籍貫為泉州)，所選樣本個體均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(RULAR)2009年最新RA診斷標準[7]。

健康對照(control)組：與RA組同時段、同地點抽取門診健康體檢者(籍貫為泉州)170 例(女性122例，男性48例)，平均年齡(41.5±20.4)歲，血常規(guī)、血脂及其它生化指標均在參考范圍內(nèi)，心電圖檢查正常，排除肝臟、腎臟、內(nèi)分泌和心腦血管疾病，無腫瘤病史和臨床特征，無遺傳疾病，無自身免疫性疾病和傳染性疾病。該研究通過福建省泉州市正骨醫(yī)院倫理委員會批準，且所有參與者均遵循“知情同意”原則。

2 方法

2.1外周血DNA提取 所有采集到的受試者EDTA、肝素或枸櫞酸鈉抗凝外周血5 mL，均預(yù)分裝200 μL于1.5 mL離心管用于全血DNA的提取。利用全血DNA提取試劑盒(北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，按照產(chǎn)品說明書提取基因組DNA，并調(diào)整最終DNA濃度為50 mg/L，置4 ℃中保存。

2.2SNP位點選取 通過對炎癥信號通路因子基因文獻的查閱[8-9]，選擇了與RA相關(guān)的3個炎癥細胞因子(IL-1β、TNF-β和IL-10)的5個SNP位點(IL-10rs1800893、IL-1β rs16944、IL-1β rs1143623、TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981)，進行與RA易感性的相關(guān)性分析。

2.3基因型分析 用軟件Primer 5.0分別設(shè)計本研究所需要的3條引物(具體序列見表1)，其中特異性引物的3′-末端核苷酸分別與SNP野生型和突變型等位基因特異互補，用來鑒別SNP 2種等位基因；在此基礎(chǔ)上設(shè)計1條可與此目標SNP所有等位基因特異性引物配對的公共引物，進行等位基因特異性PCR擴增檢測。為提高擴增特異性，在引物3’端倒數(shù)第3個堿基引入1個錯配堿基。以外周血基因組DNA為模板進行3引物擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測，對條帶位置和數(shù)目進行基因型分析。

F: forward; R: reverse.

3 統(tǒng)計學(xué)處理

等位基因及基因型頻率用基因計數(shù)法統(tǒng)計。基因型的Hardy-Weinberg平衡符合程度用2檢驗。組間基因型和等位基因頻率用2檢驗或Fisher精確概率法檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計數(shù)資料以例數(shù)及百分數(shù)(%)表示。兩組計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料的比較采用2檢驗。兩個位點間的連鎖不平衡分析，計算D′及r2，非條件Logistic回歸模型分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病關(guān)聯(lián)強度，計算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)。SHEsis軟件[10]進行單體型分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；以O(shè)R>1為與RA正相關(guān)。應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及兩組樣本間年齡、性別的校正。

結(jié) 果

1 三引物等位基因特異性擴增(TRIP-ASPCR)基因分型與測序

隨機選取樣本通過TRIP-ASPCR確定基因分型，同時利用1對外引物進行常規(guī)PCR擴增，PCR產(chǎn)物直接進行測序。測序結(jié)果與TRIP-ASPCR進行比對，結(jié)果顯示TRIP-ASPCR的分型結(jié)果和測序分型結(jié)果完全一致,見圖1。

Figure 1. Genetypes of TNF-β, IL-10 and IL-1β loci. a-1： genotype CC of TNF-β (rs1041981); a-2： genotype AA of TNF-β (rs1041981); a-3： genotype AC of TNF-β (rs1041981); b-1： genotype GG of IL-10 (rs1800893); b-2: genotype CC of IL-10 (rs1800893); b-3: genotype GC of IL-10 (rs1800893); c-1： genotype GG of IL-1β (rs1143623); c-2： genotype AA of IL-1β (rs1143623); c-3： genotype AG of IL-1β (rs1143623).

圖1 TNF-β、IL-10和IL-1β基因位點基因型

2 SNP位點基因型分布的Hardy-weinberg平衡檢驗

通過Hardy-Weinberg平衡檢驗探討所選樣本基因分型在福建泉州地區(qū)漢族人群的分布特征，本研究對5個SNPs位點的基因分型結(jié)果進行了Hardy-Weinberg平衡檢驗。分析結(jié)果顯示，正常對照組TNF-β rs1041981的SNP位點符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，RA組IL-10 rs1800893的SNP位點RA組符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，抽取人群符合隨機性原則，可認為具有群體代表性。

3 SNP位點基因型和等位基因頻率分布及其發(fā)病關(guān)聯(lián)強度分析

在Hardy-Weinberg平衡檢測的基礎(chǔ)上，開展5個SNP位點進行基因型和等位基因頻率分布及其發(fā)病關(guān)聯(lián)強度分析，計算其OR，OR>1說明疾病的危險度因暴露而增加，與疾病之間為“正”關(guān)聯(lián)，OR<1說明疾病的危險度因暴露而減少，暴露與疾病之間為“負”關(guān)聯(lián)，OR=1說明疾病與暴露無關(guān)聯(lián)，見表2～3。

正常對照組與RA組rs1800893、rs16944、rs2009658和rs1041981位點的基因型分布頻率和等位基因分布頻率均存在顯著差異(P<0.05)。(1)rs1800893基因位點的 AA、GA和GG 3種基因型在正常對照組的分布頻率與RA組存在顯著差異 (P<0.05)；等位基因A和G在正常對照組的分布頻率與RA組存在顯著差異(P<0.05)，攜帶G等位基因型的個體發(fā)生RA的相對風(fēng)險是為攜帶A等位基因型的1.678倍(P=0.005,OR=1.678,95%CI為1.167～2.412)。(2)rs16944基因位點的GG、GT和TT 3種基因型在正常對照組的分布頻率與RA組存在顯著差異 (P<0.05)；等位基因G和T在正常對照組的分布頻率與RA組亦存在顯著差異 (P<0.05)，攜帶G等位基因型的個體發(fā)生RA的相對風(fēng)險是為攜帶T等位基因型的1.418倍(P=0.030, OR=1.418, 95%CI為1.030～1.953)。(3)rs2009658基因位點的CC、CG和GG 3種基因型在正常對照組的分布頻率與RA組具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；等位基因C和G在正常對照組的分布頻率與RA組亦具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，攜帶C等位基因型的個體發(fā)生RA的相對風(fēng)險是為攜帶G等位基因型的10.67倍(P=0.000, OR=10.670, 95%CI為4.198～27.164)。(4)rs1041981基因位點的CC、CA和AA 3種基因型在正常對照組的分布頻率與RA組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；等位基因C和A在正常對照組的分布頻率分與RA組亦具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，攜帶C等位基因型的個體發(fā)生RA的相對風(fēng)險是為攜帶A等位基因型的1.533倍(P=0.015, OR=1.533, 95%CI為1.084-2.168)。

表2 兩組各SNPs多態(tài)性位點的基因型頻率分布

表3 兩組各SNPs多態(tài)性位點的等位基因頻率分布

4 SNP位點的連鎖不平衡檢驗

IL-1β rs16944和IL-1β rs1143623位點間不存在連鎖不平衡(D′=0.121，r2=0.009)；TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981位點間不存在連鎖不平衡(D′=0.465，r2=0.003)。

5 SNP位點的單倍型分析

IL-1β rs16944和IL-1β rs1143623 位點組成的單倍型G-G、G-C、A-G、A-C在對照組和RA組的分布均不存在顯著差異(P>0.05)，見表4。

TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981 2個SNP位點組成的單倍型為C-C、C-G、A-C、A-G，其中A-C單倍型在對照組和RA組的分布存在差異(P<0.05)，其余單倍型均不存在差異，A-C與RA呈正相關(guān)，且相關(guān)性明顯，攜帶A-C單倍型的個體罹患RA的風(fēng)險顯著增加(OR=1.443)，見表4。

表4 多位點單倍型分析

討 論

RA是一種自身免疫性疾病，患者關(guān)節(jié)等部位受到炎癥持續(xù)侵蝕，現(xiàn)有治療手段仍無法徹底治愈。炎癥相關(guān)因子上的單核苷酸多態(tài)性可能與非可控炎癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。

IL-1是體內(nèi)最主要的炎癥介質(zhì)之一，能夠介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)。越來越多的研究已經(jīng)證實IL-1在RA發(fā)病的過程中具有非常重要的作用[11-12]。在RA病人的血液和關(guān)節(jié)滑膜液中均可以檢測到IL-1的表達升高，這就提示了IL-1與RA的關(guān)聯(lián)[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)IL-1存在多態(tài)現(xiàn)象，已有資料顯示IL-1基因多態(tài)性在決定RA的預(yù)后上起重要作用[14]。宋新強等[15]研究發(fā)現(xiàn)IL-1β+3954位點與豫南漢族人群的RA發(fā)病風(fēng)險關(guān)系密切，但關(guān)于IL-1β等SNP位點在福建泉州地區(qū)漢族人群與RA的相關(guān)性研究仍未見報道。而在2012年Lee等[16]進行的薈萃分析中表明IL-10-1082G/A，IL-10-892C/T，IL-10-592C/A基因多態(tài)性與RA的易感性存在關(guān)聯(lián)，可見IL-10的SNP多態(tài)性與RA的遺傳易感性有關(guān)聯(lián)。

TNF-β是一種促炎因子，盡管目前對于TNF基因是否和RA易感性相關(guān)聯(lián)仍然存在爭議，但其表型在RA的發(fā)病機理和預(yù)后中扮演重要角色已得到肯定[17]。RA病人血液和滑膜液中TNF-β水平升高[18]，而關(guān)于TNF促進炎癥反應(yīng)進程的廣泛研究為TNF阻滯劑治療RA奠定了基礎(chǔ)，然而并不是所有的RA患者均能獲得良好的療效[19-21]。Kang等[22]研究表明，擁有TNF-857C/T SNP位點T基因型等位基因的患者對于依那西普的反應(yīng)要比C基因型等位基因的純合子患者要好，如果這些結(jié)論能夠得到進一步證明，TNF-857C/T SNP將成為預(yù)測療效的一個有效遺傳標記。本研究通過探討TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981與福建泉州地區(qū)漢族人群RA的相關(guān)性，以獲得福建泉州地區(qū)漢族人群的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為研究RA的基因遺傳背景提供理論依據(jù)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)資料。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 rs1800893、IL-1β rs16944、TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981等4個SNP位點的等位基因頻率在對照組和RA組間的分布差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，與RA相關(guān)性明顯，且呈正相關(guān)；其各位點分別對應(yīng)的等位基因G、G、C和C可能作為福建泉州地區(qū)漢族人群RA的一個潛在遺傳標志。