藍莓對大鼠肝纖維化模型中轉錄因子KLF11表達的影響*

洪 鑄， 楊 芳△， 楊 勤， 嚴芝強， 劉澤瑩， 劉麗榮

(貴州醫科大學 1臨床血液學教研室， 2貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室， 3病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550025)

肝纖維化是多種慢性肝損傷導致的慢性肝病所具有的共同性病理變化。目前有研究表明，食用藍莓具有一定的預防和改善肝纖維化的作用，然而其機理尚未完全明確[1]。Krüppel樣因子11(Krüppel-like factor 11, KLF11)是Krüppel樣因子家族的成員，此家族成員在哺乳動物體內廣泛分布，其C端含有高度保守的鋅指結構(C2H2型)，而N端則具有很強的多樣性，因而涉及功能復雜，目前已發現17個成員。已有的研究顯示，KLF11作為關鍵轉錄因子具有抗肝纖維化功能[2]，且其受到RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的負向調控[3]。由于花青素能夠抑制上述通路的信號[4]，而藍莓中含有高含量花青素，提示藍莓的改善纖維化作用可能與KLF11有聯系。因而在本研究中，將觀察和探討藍莓對四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導的大鼠肝纖維化的預防改善作用和其對KLF11在肝組織中表達的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實驗動物 雄性SD大鼠，清潔級，40只，體重(120±20) g，由中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心[批號：SCXK(軍)2012-0011]提供，在常溫環境(18～24 ℃)飼養。

1.2主要實驗試劑與儀器 藍莓由貴州麻江藍莓生產基地生產；抗KLF11抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；引物設計及合成由Thermo Scientific完成；RIPA裂解液購自索萊寶；TRIzol試劑購自Invitrogen；cDNA第1鏈合成試劑盒和SYBR Green試劑盒購自Thermo Scientific。CFX 9600 PCR儀購自Bio-Rad。

2 方法

2.1動物模型的制備及分組 大鼠在常溫環境正常飼養1周后隨機分為4組：正常對照組(control group)、正常藍莓對照組(blueberry group)、模型組(model group)和藍莓預防組(blueberry prevention group)。正常組常溫環境下正常飼養16周；正常藍莓對照組每100 g體重予新鮮壓榨藍莓汁1 mL灌食，連續16周；模型組以每100 g體重予CCl40.3 mL腹腔注射給藥，CCl4濃度為40%，以市售橄欖油為溶劑以2 ∶3比例配制，隔日注射1次，持續16周；藍莓預防組造模處理方法前8周同模型組，之后以每100 g體重予新鮮壓榨藍莓汁1 mL灌食，同時予相同維持劑量的CCl4，連續8周，共16周[5]。

2.2 標本采集模型制備后，腹腔注射麻醉劑麻醉動物，之后均在超凈工作臺上進行無菌操作：快速從心臟采血，無抗凝管收集，并在當天送檢；剪下肝組織，取右葉相同部位的肝以10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于病理組織檢測；剪取余下的右葉肝臟接近的部位分裝進RNA保護液、凍存管中，置于-80℃凍存備用。

2.3病理切片中肝組織增生程度的判定 按(Masson染色和HE染色)半定量分級法分為0～6級(S0～S6)，級別越高則提示肝纖維化程度越高[6]。

2.4血液相關指標的測定 委托貴州省腫瘤醫院使用Siemens Advia 2400測定各組大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平及肝纖維化4項[透明質酸(haluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen type III，PCⅢ)和Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，Col Ⅳ)]的水平。

2.5Western blot和免疫組織化學染色檢測KLF11蛋白質在肝中的表達 RIPA蛋白裂解液裂解組織，按BCA蛋白定量法計算并制作蛋白樣品，向蛋白液中加入SDS蛋白上樣緩沖液，取45 g上樣并使用SDS-PAGE分離后將蛋白電轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉100 min。膜上加入稀釋后的 I 抗[KLF11為1 ∶2 000，β-actin為1 ∶ 5 000，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)為1 ∶3 000]，4 ℃過夜。次日用TBST洗凈后加入HRP標記的 II 抗，室溫孵育1.5 h。之后使用ECL(enhanced chemiluminescence)工作液曝光。以IMAGE LAB軟件計算陰影值，KLF11表達量陰影值與β-actin表達量陰影面積的比值作為該蛋白的相對表達量，用于統計。免疫組織化學染色抗原修復采用高溫高壓修復法，使用與Western blot相同的 I 抗，孵育 II 抗后DAB顯色，蘇木素復染，細胞核顯示棕色顆粒表示KLF11為陽性，手工計數顯色得分情況[7]。由于在肝纖維化時，肝組織高表達α-SMA，使用Western blot時將其作為肝纖維化標志物一并檢測[8]。

2.6Real-time PCR檢測肝臟KLF11和Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ,ColⅠ)的mRNA表達 傳統TRIzol法提取組織總RNA，后鑒定質量和純度，行反轉錄，使用cDNA第1鏈合成試劑盒，按說明書操作后上機反應；將合成的cDNA按SYBR Green試劑盒說明書進行操作上機，主要引物序列見表1。反應條件為:95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，循環50次。結束后得出各個樣本Ct(cycle threshold)值，以正常對照組的表達量使用2-ΔΔCt法計算其余各組的目的相對表達量。

表1 Real-time PCR引物序列

3 統計學處理

用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料呈正態分布，數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間均數比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，各組資料經Levene檢驗方差齊性。等級資料用Kruskal-Wallis 秩和檢驗，組間資料多重比較用 Wil-coxon 秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠肝指數及 ALT、AST、肝纖四項水平的變化

與正常對照組比較，模型組肝纖指標HA、 ALT 和 AST 顯著增高(P<0.01)，PCⅢ增高(P<0.05)；與模型組比較，藍莓預防組HA、ALT 和 AST 顯著降低(P<0.01)，PCⅢ降低(P<0.05)，其中LN和Col Ⅳ可能因低于儀器檢測下限或其它原因未檢出，見表2。

2 病理檢查結果的分級情況

各組大鼠肝纖維化分級具有明顯差異(P<0.01)，見表3。正常組與藍莓組分級無差別(P>0.05)；與正常組相比，模型組肝纖維化分級提高(P<0.01)，以S5～S6為主；與模型組相比，藍莓預防組肝纖維化分級降低(P<0.01)，以S2～S4為主，見表3。

表2 各組大鼠血清AST、ALT、HA和PCⅢ水平的變化

*P<0.05，**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

表3 各組大鼠肝纖維化分級結果

**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group.

3 病理檢查結果分析

正常組和藍莓組肝小葉完整且無細胞變性和炎癥細胞浸潤；模型組肝小葉破壞明顯，布滿圓形假小葉，纖維增生、炎癥細胞浸潤及脂肪變性明顯；藍莓預防組纖維化程度明顯減低，纖維增生程度有所改善，輕者以脂肪變性為主，重者肝小葉結構尚在，匯管區有纖維增生和炎細胞少量浸潤，見圖1。

4 Western blot和免疫組織化學染色結果的分析

與其它各組比較比較，模型組KLF11表達顯著降低(P<0.01)，而α-SMA顯著增高(P<0.01)；藍莓預防組KLF11 表達較模型組顯著增高(P<0.01)；藍莓預防組α-SMA表達較模型組顯著降低(P<0.01)，見圖2。免疫組織化學染色結果與Western blot結果一致，見圖3。

Figure 1. Masson and HE staining of liver tissues in each group (scale bar=200 μm).

圖1 各組大鼠肝組織Masson和HE染色結果的觀察

Figure 2. The protein expression levels of KLF11 and α-SMA in the rat liver tissues of each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnormal control group;##P<0.01vsmodel group.

圖2 各組大鼠肝細胞中KLF11和α-SMA蛋白表達的變化

5 Real-time PCR檢測KLF11和ColⅠ的mRNA表達結果分析

與正常對照組比較，模型組KLF11的表達顯著降低(P<0.01)，而ColⅠ的表達顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，藍莓預防組KLF11的表達顯著增高(P<0.01)，而ColⅠ的表達顯著降低(P<0.01)；藍莓組較正常組KLF11的表達增高(P<0.05)，而ColⅠ的表達顯著降低(P<0.01),見圖4。

Figure 3. The protein expression levels of KLF11 in the rat liver tissues of each group (immunohistochemical staining, ×200).

圖3 免疫組織化學染色顯示各組大鼠肝組織中KLF11的表達變化

Figure 4. The mRNA expression levels of KLF11 and ColⅠ in the rat liver tissues of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4 各組大鼠肝細胞中KLF11和ColⅠ的mRNA表達變化

討 論

肝纖維化是多種慢性肝病的共同性病理過程，其終末期可進展為肝硬化甚至肝癌，目前大部分研究認為：在一定程度上，肝纖維化是可以逆轉的；而一旦進展為肝硬化甚至肝癌，則治療難度更大；因此，大量學者聚焦于研究肝纖維化的逆轉及其靶點的尋找上[9]。肝纖維化的發病機制主要是慢性肝損傷導致的靜止態肝星狀細胞激活，釋放大量的以SMA和膠原蛋白為主的細胞外基質堆積；而肝損傷會導致ALT、AST從肝細胞中溢出從而使得血清ALT和AST水平升高[8]。本研究結果顯示，模型組血清肝損傷指標ALT和AST及肝纖維化指標HA和PCⅢ均顯著高于正常對照組；在病理肝纖維化分級上，模型組以S5～S6級為主，而正常組以S0級為主，模型組分級高于正常組對照組；Masson染色顯示正常組肝小葉完整且無細胞變性和炎癥細胞浸潤，模型組肝小葉破壞明顯，布滿圓形假小葉，纖維增生、炎癥細胞浸潤及脂肪變性明顯，呈現出典型的肝纖維化形態學特點；且模型組α-SMA蛋白表達水平顯著高于正常對照組；上述結果均顯示造模成功。與模型組相比，藍莓預防組血清肝損傷指標ALT、AST及肝纖維化指標HA、PCⅢ均顯著降低，肝纖維化等級以S2-S4為主，分級降低，α-SMA蛋白表達水平顯著降低；相對于模型組的典型肝纖維化，藍莓預防組纖維化增生得到改善、炎癥細胞浸潤減少，均直接說明食用藍莓具有一定的預防和逆轉肝纖維化的作用。與正常對照組相比，藍莓組KLF11的mRNA表達水平提高，說明正常狀態下食用藍莓在轉錄水平上能夠提高KLF11的表達；與肝纖維化組相比，藍莓預防組KLF11的mRNA和蛋白水平均顯著提高，說明在肝纖維化模型中食用藍莓能夠提高和促進肝臟內KLF11的表達水平。

本實驗藍莓為貴州麻江藍莓生產基地生產，經過該基地反復培育，其藍莓有效營養物質含量逐年增加，具有糖脂比低、營養成分高的特點，其中花青素(anthocyanin)含量高達(0.901±0.473) g/100 g[5]。Kalt等[10]發現，動物在食用藍莓后，花青素會出現在肝臟中。Chen等[4]發現花青素能夠抑制RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的主要蛋白和mRNA表達，而目前已確定的KLF11上游信號通路較少，RAS-RAF-MEK-ERK便是KLF11的已知關鍵負向調控因素，ERK信號能通過磷酸化KLF11和干擾KLF11募集mSin3a-HDAC復合物，從而阻斷KLF11對基因表達的抑制作用，因此我們推測食用含有大量花青素的藍莓，很可能通過此通路調節KLF11的表達[11]。KLF11作為關鍵轉錄因子在對抗多種體內組織器官纖維化中具有重要作用，包括其能對抗子宮內膜纖維化、心肌纖維化、肝纖維化，KLF11能直接與ColⅠ的基因啟動子結合，且可以通過HP1-HMT染色質重塑途徑直接下調ColⅠ的表達，從而抑制肝纖維化發生，因此我們檢測了不同組別之間ColⅠ的mRNA表達量[12-13]。本次研究結果發現：藍莓預防組ColⅠ的mRNA表達水平顯著低于模型組，而KLF11在藍莓預防組表達較模型組高，說明在發生肝纖維化的狀態下藍莓可以提高大鼠模型體內KLF11的蛋白質表達水平，這些KLF11可能在轉錄水平上影響和降低了ColⅠ的表達，從而抵制肝纖維化的發生；此外，藍莓組較正常組在KLF11的mRNA表達水平高，但在蛋白表達水平無顯著差異，而藍莓組ColⅠ的mRNA表達顯著低于正常組，說明正常情況下藍莓能在轉錄水平提高KLF11的表達儲備，但在KLF11之外可能尚有其他影響ColⅠ表達的因素存在。

綜上所述，食用藍莓可以一定程度上預防和降低肝纖維化水平，這與詹瑋等[5]研究結果一致；在肝纖維化發生時，藍莓可能通過促進KLF11的表達從而降低肝纖維化水平，我們猜測其機制很可能是通過藍莓花青素抑制RAS-RAF-MEK-ERK信號通路使得KLF11表達增多，之后KLF11通過募集mSin3a-HDAC復合物、結合ColⅠ的基因啟動子區及通過HP1-HMT染色質重塑途徑，共同下調Ⅰ型膠原蛋白的表達[11-13]，從而達到改善肝纖維化的效果，但是否經此途徑亦或是還有之外的調控途徑，尚需要深入研究。由于藍莓花青素是天然的植物成分，易于獲得，而已發現KLF11作為一種關鍵的抑制性轉錄因子在如多種惡性腫瘤、糖尿病、器官纖維化等疾病中均存在表達降低的現象[13-17]，說明KLF11是尚未研究透徹的重要角色，因此藍莓花青素-RAS-RAF-MEK-ERK-KLF11的潛在信號通路其作用方式及靶點，值得深入研究。