人類EGFR基因突變核酸標準物質的研制

李 達 王 軍 楊 忠 王會如*

肺癌是我國的高發癌種，且發病率逐年上升，而腫瘤細胞增殖取決于改變的致病基因信號通路。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)屬于HER超家族的一種，EGFR信號通路的失調參與癌變已被公認，并與惡性疾病及不良預后相關聯[1]。EGFR基因是肺腺癌的主要突變基因，在亞裔人群中突變比率占到46.9%。目前，EGFR基因突變患者主要受益于EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)的靶向治療[2]。EGFR基因酪氨酸激酶區域18～21號外顯子的體細胞活化突變被證實可以作為小分子EGFR-TKI治療相應的有效預測因子，常見的突變類型包括p.G719X、19號外顯子插入缺失、p.T790M和p.L858R的4種[3]。

腫瘤基因檢測產品的迅速涌現，成為體外診斷行業分子診斷的新寵。分子診斷產品是繼生化、免疫診斷產品之后的又一新產品，在腫瘤基因檢測、產前篩查、病原微生物檢測、耐藥基因檢測等方面具有靈敏度高、特異性強及診斷窗口期短等優勢。但檢測環境要求高、操作流程復雜，樣本制備與檢測都難以實現自動化。按照國家藥品監督管理局《體外診斷試劑注冊管理辦法》[4]分子類體外診斷試劑歸為第三類高風險產品，按照產品監管要求，產品校準品應具有溯源性[5]。然而，市場上適合分子類產品的國際或國家標準物質非常有限。因此，研制適用于分子類體外診斷產品溯源的標準物質，對規范我國分子診斷試劑產品具有重要意義。本研究研制的標準物質涵蓋了EGFR基因18～21號外顯子的p.G719S、p.E746_A750delELREA(簡寫p.Ex19del)、p.T790M和p.L858R最常見的肺癌致病基因4個突變位點，通過廣泛測試已上市的腫瘤基因檢測產品，將對分子診斷市場產生重要的借鑒和指導意義。

1 材料與方法

1.1 基因和標準物質

人工合成兩種片段，分別含有EGFR基因第18、19、20、21號外顯子序列。其中，Fragment-WT為野生型，片段長度1483bp；Fragment-MU為突變型，含有EGFR基因p.G719S、p.Ex19del(COSM6225)、p.T790M和p.L858R的4種突變類型。合成檢測EGFR基因p.G719S、p.Ex19del、p.T790M和p.L858R的4種突變類型引物和探針，分別命名為G719S探針、Ex19del探針、T790M探針和L858R探針[6]。購買ATCC含有EGFR基因突變的細胞系傳代培養并提取DNA，按照不同的突變比率混合成不同突變頻率的6種標準物質。

1.2 儀器與試劑

QX200微滴式數字聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國伯樂公司)和Quantstudio 3D數字PCR儀(美國ABI公司)。廠家配套試劑包括ddPCR Supermixes(美國伯樂公司)和Master Mix(美國ABI公司)，芯片DG8TMCartridges and Gaskets(美國伯樂公司)和QuantStudioTM3D Digital PCR 20K Chip Kit v2(美國ABI公司)等。

1.3 檢測方法

建立數字PCR實驗體系，利用合成的EGFR基因4組引物探針按照QX200試劑說明書測試，找到合適的退火溫度和濃度。每次實驗設置空白對照，保證操作無污染。

1.4 統計學方法

采用SPSS19統計軟件采用ANOVA方法進行顯著性分析，均勻性驗證采用F檢驗方法，以α=0.05判斷差異[7]。以P＜0.05為有顯著性。

2 結果

2.1 探針體系

將Fragment-WT和Fragment-MU片段按照質量比為1∶1進行混合，理論上EGFR基因p.G719S、p.Ex19del、p.T790M和p.L858R的4種突變頻率均為50%，按照梯度稀釋，建立標準曲線。從50個拷貝數到50000個拷貝數，定值結果表現出較高的一致性。比較上樣量發現，當拷貝數在1000個時，G719S探針、Ex19del探針、T790M探針和L858R探針得到的突變頻率結果差異最小，見圖1。

圖1 四種定量探針性能評估

2.2 標準物質的均勻性驗證

在6種水平的標準物質中各選取15支，每支做3次重復，采用單因素方差分析方法，數值做F檢驗(Fα=0.05=2.04)，其差異均無統計學意義(P＞0.05)；不確定度隨著基因突變頻率的依次降低。標準物質各特性值的不確定度見表1。

表1 標準物質均勻性不確定度(%)

2.3 標準物質的定值

每種標準物質選3支，分獨立3次實驗重復，每次實驗每支做1次重復，共得到9個獨立實驗數據。結果中每支標準物質含有的4個特性值稍有差異，最高值是RM-1的p.Ex19del特性值，為19.04%，最低值是RM-6的p.G719S特性值，為0.51%，見圖2。

圖2 標準物質定值結果

2.4 不同平臺定值比較

本研究用伯樂G719S分型探針和賽默飛世爾Ex19del、T790M和L858R分型探針在兩種數字PCR平臺上對標準物質做定值，除標準物質RM-4的p.L858R特性值出現定值顯著性差異以外，其余標準物質的特性值在不同探針的定值結果間無顯著性差異，其定值探針與商業化探針相比具有較好的可比性，見圖3。

2.5 模擬降解穩定性

由于標準物質在保存過程中會隨時間的推移逐漸降解，故采用DNA片段化酶模擬降解DNA，DNA降解后片段大小在100～750 bp之間，見圖4。

圖3 不同探針的定值結果

圖4 標準物質模擬降解電泳圖

QX200數字PCR定量后，RM-1、RM-5和RM-6的特性值在DNA降解后升高，最大變異為22.9%，最小為3.0%。RM-2、RM-3和RM-4的特性值變化趨勢不明顯，RM-2特性值p.L858R升高10.3%，而RM-4特性值p.G719S則降低18.7%，見圖5。

圖5 標準物質降解后定值的變異范圍

3 討論

本研究初步描述了人類EGFR基因突變核酸標準物質的研制信息，從前期數字PCR定值體系的建立，到均勻性、穩定性方面做簡要描述。數字PCR方法是目前公認的核酸定值方法，具有不依賴于定標曲線、靈敏度高、不受擴增效率影響等優點[8]。然而，在實驗中發現，不同位點的探針設計和基因位點仍會影響最終的實驗結果。因此，不同實驗體系和數字PCR平臺的相互驗證非常重要。通過比較伯樂[9]和賽默飛世爾[10]兩個平臺發現，本研究的標準物質的定值有較好的一致性。此外，本研究正在用JN Medsys數字PCR和Naica的Crystal數字PCR[11]做測試，希望得到更準確的數值。

EGFR基因突變在非小細胞肺癌診斷意義明確，國內外體外診斷產品種類豐富[12]。然而，作為衡量產品質量的標準物質缺乏，很難有效的評價產品的性能指標。EGFR基因突變標準物質的研制，很好的填補了EGFR基因突變檢測體外診斷產品量值準確性的性能評價空白。標準物質涵蓋了EGFR基因突變最常見的4個位點，最大突變頻率為19.0%，最小為0.51%，突變頻率范圍廣，符合臨床上從實體瘤到游離DNA的檢測范圍[13]。

近年來，高通量測序檢測EGFR基因突變的產品陸續進入市場，人類EGFR基因突變核酸標準物質是否能夠適合不同原理的測序平臺，如可逆末端終止法、半導體合成測序法和復合探針錨雜交法等[14-16]將做進一步的研究。

4 結論

本研究初步描述了人類EGFR基因突變核酸標準物質的研制信息，從數字PCR實驗體系到獲得的標準物質結果。邀請各體外診斷試劑儀器生產廠家、臨床檢驗機構和醫學實驗室試用，目的在于讓試用單位了解標準物質的特點，以便更好地完成標準物質的研制，提供完善標準物質的特征信息。