黑豆添加微量元素發(fā)芽后對雌性大鼠更年期綜合征的影響

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(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東濟(jì)南 250355; 2.山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司,山東德州 251200)

女性更年期綜合征是指女性在絕經(jīng)前后,由于性激素含量的減少導(dǎo)致的一系列精神及軀體表現(xiàn),如植物神經(jīng)功能紊亂、生殖系統(tǒng)萎縮等,還可能出現(xiàn)一系列生理和心理方面的變化,如焦慮、抑郁和睡眠障礙等,嚴(yán)重影響自己和他人的工作和生活[1]。

大豆異黃酮因具有植物類雌激素作用,近年來越來越引起國內(nèi)外學(xué)者們的注意,其對婦女更年期綜合征有較好的治療作用[2-3]。張曉鵬等[4]設(shè)計了雌激素低下模型,模擬更年期潮熱癥狀,通過選用不同劑量的大豆異黃酮對該模型進(jìn)行驗證,結(jié)果表明大豆異黃酮能夠在一定程度上改善該模型造成的更年期綜合征。針對婦女更年期綜合征的主要并發(fā)癥絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥,學(xué)者們從臨床的角度,證實了大豆異黃酮通過增加更年期患者的骨密度來有效改善婦女更年期綜合征癥狀[5-6]。溫少霞等[7]通過對更年期綜合征患者補(bǔ)充大豆異黃酮50～150 mg/d,表明大豆異黃酮可緩解消除婦女更年期綜合征的各癥候群。

研究表明,鋅、錳、銅、鐵等微量元素均能提高大豆異黃酮的含量[8]。此外,經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),大量更年期綜合征患者的血清中鋅、錳、銅、鐵含量均明顯偏低[9-10],提示微量元素的缺失可能是發(fā)病原因之一。調(diào)查中還發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎常作為治療更年期綜合征的基礎(chǔ)療法,對該現(xiàn)象進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎中藥及復(fù)方中含有大量人體所必需的微量元素,尤其以鋅、錳、銅、鐵的含量最為顯著[11],這就從微量元素方面,證明了更年期綜合征可用補(bǔ)腎中藥治療是正確的。“黑豆入腎功多”,自古以來就有補(bǔ)腎的功效,且黑豆中含有的異黃酮成分,已被研究證實能夠有效地消除婦女更年期的不適,廣泛用于婦女更年期綜合征的治療[12]。翟瑋瑋等[13]研究發(fā)現(xiàn),黑豆發(fā)芽使得蛋白質(zhì)含量增加的同時,其平均分子量也下降。生物代謝實驗證明,物質(zhì)是以小分子的形式被人體吸收利用的[14]。由此可見,黑豆經(jīng)發(fā)芽處理后更易于為人體所吸收,從而提高其營養(yǎng)價值。目前,研究黑豆通過添加微量元素發(fā)芽提高黑豆的營養(yǎng)價值,及對更年期綜合征影響的文獻(xiàn)較少。

因此,本研究以健康雌性SD大鼠為實驗動物,制備摘除卵巢的大鼠(去勢大鼠)動物模型,通過添加鋅、錳、銅、鐵四種微量元素,創(chuàng)新發(fā)芽方式,考察黑豆添加微量元素發(fā)芽后對摘除卵巢的雌性大鼠生殖內(nèi)分泌的影響,以期為黑豆添加微量元素發(fā)芽應(yīng)用于更年期綜合征的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級SD雌性大鼠 使用孕產(chǎn)后雌性大鼠,體重(415±30) g,70只,購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司(動物許可證號:SCXK(魯)2014-0007),飼養(yǎng)環(huán)境:室溫23～25 ℃,相對濕度35%～65%;黑豆 生品,黑龍江牡丹江市;乙醇 分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;硫酸鋅 分析純,天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心;硫酸錳 分析純,天津博迪化工股份有限公司;硫酸銅 分析純,天津市鼎盛鑫化工有限公司;硫酸亞鐵 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠;吐溫-80(P1751) 美國Sigma公司;水 均為蒸餾水,自制;雌二醇(E2)放射免疫試劑盒(批號20180119)、卵泡刺激素(FSH)放射免疫試劑盒(批號20180119) 北京華英生物技術(shù)研究所;己烯雌酚片(H44024916) 廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司;10%水合氯醛 自制。

FW100高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;CN-A320B型豆芽機(jī) 佛山市順德區(qū)嘉壕實業(yè)有限公司;XH-6020全自動放免計數(shù)儀 西安核儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物的制備

1.2.1.1 生黑豆 將黑豆粉碎后,過80目篩,得到生黑豆粉,加1%吐溫-80配制成生黑豆組的藥物溶液。

1.2.1.2 清水發(fā)芽黑豆 將黑豆用蒸餾水洗凈表面,用75%乙醇溶液消毒10 min,洗至無醇味,25 ℃避光條件下用蒸餾水浸泡6 h,取出,再次用蒸餾水將泡發(fā)的黑豆種子清洗干凈,置于豆芽機(jī)中,25 ℃環(huán)境溫度下以水噴灑發(fā)芽,至芽長12 cm,將發(fā)芽黑豆50 ℃烘箱中烘干,粉碎后,過80目篩,得到清水發(fā)芽黑豆粉,加1%吐溫-80配制成清水發(fā)芽黑豆組的藥物溶液。

表1 大鼠用劑量換算Table 1 Rat dose conversion

1.2.1.3 添加微量元素發(fā)芽黑豆 同1.2.1.2項下的制備方法,把浸泡及噴灑發(fā)芽用的蒸餾水換成含硫酸鋅30 mg/L、硫酸錳20 mg/L、硫酸銅10 mg/L、硫酸亞鐵20 mg/L的混合溶液。置于豆芽機(jī)中,25 ℃環(huán)境溫度下噴灑發(fā)芽,至芽長12 cm,將微量元素發(fā)芽黑豆50 ℃烘箱中烘干,粉碎后,過80目篩,得到添加微量元素發(fā)芽黑豆粉,加1%吐溫-80配制成清水發(fā)芽黑豆組的藥物溶液。

1.2.2 造模方法 實驗前,將健康雌性大鼠放置在動物房里,適應(yīng)環(huán)境3 d用10%水合氯醛液對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉注射后,仰臥位固定大鼠,切開腹腔,找到卵巢。剪取時,先將卵巢下輸卵管(包括脂肪)用絲線結(jié)扎,再摘除卵巢,術(shù)后順勢將子宮宮角送回腹腔中,然后放入適量的青霉素以預(yù)防感染。同法摘除另一側(cè)卵巢。

1.2.3 分組與給藥 SD雌性大鼠共70只,取10只為正常組,剩余60只進(jìn)行卵巢摘除造模,隨機(jī)分為6組,分別為模型組、陽性藥組(己烯雌酚)、生豆組、清水發(fā)芽組(以下稱清水組)、添加微量元素發(fā)芽低劑量組(以下稱富微低組)、添加微量元素發(fā)芽高劑量組(以下稱富微高組),每組10只。除正常組、模型組灌胃蒸餾水(按1 mL/100 g動物體重灌胃)外,其余劑量換算按實驗動物與人體重等效量換算[15-19]。

1.2.4 實驗動物與人體重等效量換算 計算公式如下。

式中:D(a)表示大鼠用劑量,mg/kg;D(b)表示成人每天服用劑量,mg/d;K表示換算系數(shù)6.3;W表示人體標(biāo)準(zhǔn)重量,60 kg。

按上述計劃,在造模后即日開始給藥,按1 mL/100 g動物體重灌胃,1次/d,連續(xù)給藥6周(42 d)。

1.2.5 指標(biāo)檢測

1.2.5.1 陰道上皮細(xì)胞角化實驗 分別于給藥周期的最后5 d,于每日給藥后2 h(可固定適宜的時間,即確保同一時間)進(jìn)行大鼠陰道涂片檢查。具體方法如下:用預(yù)先浸有0.9%生理鹽水的棉簽,輕輕插入陰道2～3 cm,以適當(dāng)?shù)牧Χ容p刮陰道前壁,將棉簽在標(biāo)有編號的載玻片上向一個方向滾涂,自然風(fēng)干后以5%美藍(lán)溶液染色10 min,接著用水輕輕沖去多余的染色液,再次自然風(fēng)干,陰道涂片即制作完成[20]。顯微鏡下觀察去勢大鼠陰道涂片,并記錄最后一天角化上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、白細(xì)胞含量數(shù)據(jù)。

1.2.5.2 血清性激素(E2、FSH)的測定 末次給藥前禁食12 h給藥后1 h,麻醉大鼠,腹主動脈取血后室溫下靜置,以1000 r/min下離心10 min,取血清,以Elisa法檢測各組血清性激素表達(dá)水平。

1.2.5.3 子宮病理切片觀察 將子宮組織分別固定在10%甲醛溶液中,依次進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、普通HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠子宮形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0軟件,實驗數(shù)據(jù)采用X±SD表示,P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂富微發(fā)芽黑豆粉對去勢更年期模型大鼠角化上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、白細(xì)胞含量的影響

與正常組相比,模型組陰道角化上皮細(xì)胞含量極顯著降低86%(P<0.01),陰道上皮細(xì)胞角化程度與體內(nèi)雌激素水平成正比,所以陰道上皮細(xì)胞角化程度間接地說明雌激素活性的大小,說明摘除卵巢致更年期綜合征大鼠造模成功,且不影響大鼠生命。同時與正常組相比,模型組的白細(xì)胞含量極顯著升高1233%(P<0.01),上皮細(xì)胞含量極顯著降低96%(P<0.01)。

與模型組相比,生豆組能極顯著升高角化上皮細(xì)胞含量與上皮細(xì)胞含量281%、1125%(P<0.01),顯著降低白細(xì)胞含量38%(P<0.05);與模型組相比清水組能極顯著升高角化上皮細(xì)胞含量與上皮細(xì)胞含量362%、675%(P<0.01),顯著降低白細(xì)胞含量68%(P<0.05);與模型組相比,富微低組能極顯著升高角化上皮細(xì)胞含量與上皮細(xì)胞含量455%、2100%(P<0.01),顯著降低白細(xì)胞含量52%(P<0.05)。與模型組相比,富微高組能極顯著升高角化上皮細(xì)胞含量與上皮細(xì)胞含量466%、1650%(P<0.01),顯著降低白細(xì)胞含量61%(P<0.05)。各組對去勢更年期模型大鼠的角化上皮細(xì)胞含量升高作用表現(xiàn)為:富微高組>富微低組>清水組>生豆組。對上皮細(xì)胞含量升高作用表現(xiàn)為:富微低組>富微高組>生豆組>清水組。對白細(xì)胞含量降低作用表現(xiàn)為清水組>富微高組>富微低組組>生豆組。據(jù)報道[21],大鼠陰道內(nèi)容物主要由角化上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、白細(xì)胞組成,角化上皮細(xì)胞的增加說明大鼠雌激素活性增加。此實驗結(jié)果說明黑豆能有效改善更年期癥狀,與黑豆中的大豆異黃酮有關(guān)。

表2 角化上皮細(xì)胞含量、上皮細(xì)胞含量、白細(xì)胞含量(X±SD)Table 2 Contents of keratinized epithelial cells,epithelial cells and white blood cells(X±SD)

注:與正常組相比,#:P<0.05,##:P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與生豆組相比,a:P<0.05;與清水組相比,b:P<0.05,bb:P<0.01;與陽性藥組相比,c:P<0.05,cc:P<0.01;與富微低組相比,d:P<0.05;下同。

與生豆組相比,清水組能顯著升高角化上皮細(xì)胞含量21%(P<0.05),顯著降低上皮細(xì)胞含量與白細(xì)胞含量37%、48%(P<0.05);富微低組與生豆組相比,能顯著升高角化上皮細(xì)胞含量46%(P<0.05),顯著降低白細(xì)胞含量23%(P<0.05),顯著升高上皮細(xì)胞含量44%(P<0.05);富微高組與生豆組相比,能顯著升高角化上皮細(xì)胞含量48%(P<0.05),顯著降低白細(xì)胞含量37%(P<0.05),顯著升高上皮細(xì)胞含量43%(P<0.05)。此實驗說明黑豆發(fā)芽12 cm后,比沒有發(fā)芽的黑豆對去勢更年期模型大鼠的雌激素活性增加,這是因為發(fā)芽后黑豆中大豆異黃酮含量增加,大豆異黃酮能夠在一定程度上改善該模型造成的更年期綜合征。

與清水組相比,富微低組能顯著升高角化上皮細(xì)胞含量19%(P<0.05),顯著升高白細(xì)胞含量49%(P<0.05),極顯著升高上皮細(xì)胞含量184%(P<0.01);富微高組與清水組相比,能顯著升高角化上皮細(xì)胞含量22%(P<0.05),顯著升高白細(xì)胞含量22%(P<0.05),極顯著升高上皮細(xì)胞含量126%(P<0.01)。此實驗說明在發(fā)芽過程中添加微量元素能夠使黑豆中大豆異黃酮含量增加,從而使更年期模型大鼠的雌激素活性增加。

與陽性藥組相比,富微低組顯著降低了角化上皮細(xì)胞含量14%(P<0.05),極顯著升高了白細(xì)胞含量92%(P<0.01);富微高組顯著降低了角化上皮細(xì)胞含量12%(P<0.05),顯著升高了57%白細(xì)胞含量(P<0.05)。此實驗說明,富微發(fā)芽黑豆能使去勢更年期模型大鼠的雌激素活性增加,但與陽性藥組相比,還有一定差距。

與富微低組相比,富微高組角化上皮細(xì)胞含量沒有顯著性差異;白細(xì)胞含量顯著降低了18%(P<0.05),上皮細(xì)胞含量顯著降低20%(P<0.05)。此實驗說明,高劑量富微發(fā)芽能使去勢更年期模型大鼠的炎癥減輕,但對去勢更年期模型大鼠的雌激素活性與富微低組沒有差異。

2.2 飼喂富微發(fā)芽黑豆粉對去勢更年期模型大鼠血清性激素(E2、FSH)的影響

由表3可知，與正常組相比,模型組大鼠的E2值顯著降低68%(P<0.05),FSH顯著升高28%(P<0.05)。與模型組相比,生豆組E2極顯著升高85%(P<0.01),FSH極顯著降低12%(P<0.01)。清水組、富微高組、富微低組與模型組相比,E2沒有升高反而降低。清水組與模型組相比對FSH沒有顯著影響。富微高組、富微低組與模型組相比FSH分別顯著降低10%、14%(P<0.05)。根據(jù)前人的研究得出[22],更年期婦女由于機(jī)體植物神經(jīng)失調(diào),卵泡性激素下降導(dǎo)致E2水平下降,FSH水平上升,常產(chǎn)生焦慮、煩躁、抑郁等不良心理,用藥后E2升高,隨E2增加達(dá)一定水平時,又反饋性抑制FSH分泌。本實驗在檢測過程中發(fā)現(xiàn)清水組、富微高組、富微低組與模型組相比E2沒有升高反而降低,其原因可能是發(fā)芽后增加的大豆異黃酮不是影響E2與FSH水平的因素,或可能是實驗?zāi)Ｐ突驅(qū)嶒瀸ο蟛煌瑢?dǎo)致與前人的結(jié)果有差異。

表3 血清性激素(E2、FSH)含量測定(X±SD)Table 3 Content determination of serum sex hormones(E2,FSH)(X±SD)

與生豆組相比,清水組、富微低組、富微高組不能使E2增加,FSH沒有顯著性差異。與清水組相比,富微低組能顯著升高E245%(P<0.05),FSH沒有顯著性差異;富微高組與清水組相比E2、FSH沒有顯著性差異。與陽性藥組相比,富微高組與富微低組不能使E2增加,FSH沒有顯著性差異。與富微低組相比,富微高組不能使E2增加,FSH沒有顯著性差異。

2.3 子宮病理切片結(jié)果

子宮病理切片顯微照片見圖1。在100倍鏡頭下可以看到,正常組子宮內(nèi)膜厚度減少,子宮腺體數(shù)量減少,形成較多顯微組織增生和細(xì)胞間質(zhì);模型組子宮內(nèi)膜厚度變薄,大量炎性細(xì)胞侵潤,平滑肌增生明顯,且排列無序,子宮腺體數(shù)量明顯減少,形成較多顯微組織增生和細(xì)胞間質(zhì),或見到空泡狀的腺體;陽性藥組子宮內(nèi)膜厚度增加,炎性細(xì)胞浸潤減少,平滑肌增生減少,排列致密,子宮腺體數(shù)量略有增加,顯微組織增生和細(xì)胞間質(zhì)現(xiàn)象減少;生豆組子宮內(nèi)膜厚度未見明顯變化,炎性細(xì)胞浸潤有所減少,子宮腺體數(shù)量較少,顯微組織增生和細(xì)胞間質(zhì)現(xiàn)象未有減少;清水組子宮內(nèi)膜厚度有所增加,顯微組織增生和細(xì)胞間質(zhì)現(xiàn)象未有減少,腺體周圍炎性浸潤明顯,局部觀察到平滑肌增生明顯,排列致密;富微低組子宮內(nèi)膜明顯厚度增加不明顯,炎性細(xì)胞浸潤未獲明顯的減輕,顯微組織增生和細(xì)胞間質(zhì)現(xiàn)象未有減少,腺體周圍炎性浸潤明顯,局部觀察到平滑肌增生明顯,排列致密;富微高組子宮內(nèi)膜明顯增厚,炎性細(xì)胞浸潤有所減輕,腺體數(shù)量增多,腺體周圍炎性浸潤減輕,平滑肌排列致密,病理性增生減少。

圖1 大鼠子宮病理切片(HE染色,100×)Fig.1 Uterine pathological section of rats(HE staining,100×) 注:1:正常組;2:模型組;3:陽性藥組;4:生豆組; 5:清水組;6:富微低組;7:富微高組。

3 討論與結(jié)論

微量元素對人體具有十分重要的作用,為人體健康所必需。如果體內(nèi)缺少某些微量元素,可以引起相應(yīng)的疾病,因此不少疾病的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)微量元素有明顯的直接關(guān)系。而更年期患者血清中鋅、錳、銅、鐵含量均明顯偏低[23]。大豆異黃酮在改善更年期綜合征癥狀的作用很明顯,尤其是在改善潮熱出汗和失眠作用更為突出。本研究通過添加微量元素發(fā)芽提高黑豆中大豆異黃酮的含量,研究黑豆添加微量元素發(fā)芽后對雌性大鼠更年期綜合征的影響。結(jié)果顯示,給摘除卵巢的大鼠灌胃添加微量元素發(fā)芽至12 cm的黑豆芽粉后,與模型組相比,富微高組與富微低組均能使陰道角化上皮細(xì)胞含量極顯著升高(P<0.01),各組對角化上皮細(xì)胞含量升高效果表現(xiàn)為富微高組>富微低組>清水組>生豆組,且富微高組與富微低組均能使摘除卵巢的大鼠子宮內(nèi)膜厚度明顯增厚,腺體數(shù)量增多,病理性增生減少,炎性浸潤減輕。

本文在本團(tuán)隊的研究基礎(chǔ)[24]上,通過添加鋅、錳、銅、鐵四種微量元素,創(chuàng)新采用發(fā)芽有機(jī)轉(zhuǎn)化的方式,既提高了黑豆中對更年期綜合征有確切療效的異黃酮苷元的含量(另文詳述),又增加了微量元素的攝入量,提升了黑豆的營養(yǎng)價值。本文研究可為黑豆富微發(fā)芽應(yīng)用于更年期綜合征的治療提供實驗依據(jù)。