低深度拷貝數(shù)變異測(cè)序在胎兒先天性心臟病中的應(yīng)用研究

黃杏玲 王遠(yuǎn)流 鄧新娥 陳惠 劉百靈 梅燕

(柳州市婦幼保健院圍產(chǎn)保健科，廣西 柳州 545001)

胎兒先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是最常見的出生缺陷，遺傳綜合型的CHD同時(shí)還伴有神經(jīng)發(fā)育障礙、生長(zhǎng)發(fā)育障礙等表現(xiàn)，手術(shù)后仍不能獲得正常的生活質(zhì)量[1-3]。基于NGS 技術(shù)的基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序(copy number variation sequencing，CNV-seq)為產(chǎn)前診斷提供了新的手段，為胎兒CHD遺傳病因的發(fā)現(xiàn)提供新的技術(shù)。本研究旨在評(píng)價(jià)CNV-seq分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷CHD 致病基因中的臨床應(yīng)用價(jià)值，探索CHD與染色體亞顯微異常的關(guān)系，為CHD的早期診斷、治療和遺傳阻斷提供依據(jù)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 2017年1月至2019年5月在柳州市婦幼保健院進(jìn)行超聲頸項(xiàng)透明層的檢查和/或系統(tǒng)彩超或針對(duì)胎兒超聲心動(dòng)圖檢查等，被產(chǎn)前超聲診斷為胎兒心臟異常伴或不伴心外異常的孕婦。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的審查。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)兩名具有產(chǎn)前超聲診斷資質(zhì)的醫(yī)師診斷胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常伴或不伴心外異常的孕婦(2)經(jīng)產(chǎn)前遺傳咨詢并知情同意行介入性產(chǎn)前診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有介入性產(chǎn)前診斷禁忌或拒絕產(chǎn)前診斷的孕婦(2)心臟表型只涉及心律失常或心包積液的胎兒或重度地貧的胎兒。最終納入研究病例181例，其中孤立性CHD146例，伴有心外異常的CHD35例；孕周17+2周-34+3周，平均孕周(23.7±2.9)周；年齡16～44歲，平均年齡(29.8±5.6)周。

1.2研究方法 (1)染色體核型分析：所獲取的羊水和臍血進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，以G顯帶染色(必要時(shí)加做C顯帶或N顯帶)制備染色體標(biāo)本,每例標(biāo)本按照ISCN(2016)標(biāo)準(zhǔn),油鏡下分析20個(gè)分散好、中等長(zhǎng)度的中期分裂相,發(fā)現(xiàn)嵌合體或異常核型時(shí)加數(shù)到100個(gè)分裂相。(2)CNV-seq檢測(cè)：①提取基因組DNA；②DNA文庫(kù)構(gòu)建；③上機(jī)測(cè)序；④生物信息學(xué)分析；然后通過(guò)檢索 UCSC、DECIPHER、OMIM、Clin Var、DGV、PUBMED等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行CNV臨床意義的確定。

2 結(jié) 果

2.1胎兒CHD染色體異常結(jié)果 染色體核型分析檢出染色體非整倍體或結(jié)構(gòu)重排共有20例(20/181，11.0%)，包括15例染色體非整倍體(21-三體最常見)，3例染色體大片段的缺失，1例嵌合體、1例22號(hào)染色體短臂異染色質(zhì)。CNV-seq分析技術(shù)檢出染色體拷貝數(shù)異常43例，檢出率為23.8%(43/181)，其中有明確致病意義的為15.5%(28/181)，臨床意義不明的為3.9%(7/181)，良性變異CNV有8例。染色體核型分析正常的161例CHD 胎兒中，CNV-seq分析技術(shù)檢出8例染色體拷貝數(shù)微缺失/微重復(fù)，檢出率為5.0%(8/161)。

2.2染色體核型分析正常的CHD胎兒中8例致病性CNV結(jié)果分析 病例編號(hào)13是法絡(luò)氏四聯(lián)癥，右位主動(dòng)脈弓，動(dòng)脈導(dǎo)管未見顯示，CNV-seq分析提示22q11.21處缺失片段大小為2.9Mb區(qū)域，包含 22q11 deletion syndrome的全部，涉及TBX1、CDC45L等多個(gè)致病基因。病例編號(hào)41是胎兒室間隔缺損，CNV-seq分析提示16號(hào)染色體p13.3-13.13處重復(fù)11.42Mb區(qū)域，包含Chromosome 16p13.3 duplication syndrome，主要涉及CREBBP、ABAT等多個(gè)致病基因。病例編號(hào)50是胎兒肺動(dòng)脈干增寬，CNV-seq分析提示1號(hào)染色體q43-q44處缺失5.86Mb區(qū)域，包括了AKT3、NLRP3等多個(gè)OMIM基因。病例編號(hào)78是胎兒心臟異常，CNV-seq分析提示7號(hào)染色體q11.23處缺失1.70Mb區(qū)域，包含 Williams-Beuren Syndrome (WBS)的全部，涉及OMIM基因有NCF1、ELN、SVAS、ADCL1。病例編號(hào)114是胎兒法洛四聯(lián)癥、永存左上腔靜脈、十二指腸梗阻，CNV-seq分析提示2號(hào)染色體p16.1-p14處缺失4.48Mb區(qū)域，主要涉及SLC1A4、EHBP1等致病基因；病例編號(hào)137是永存左上腔靜脈Ib型，CNV-seq分析提示22號(hào)染色體q13.2-q13.33處缺失7.94Mb區(qū)域，該區(qū)域主要涉及SHANK3,PSAP2等多個(gè)致病基因；病例編號(hào)144也是永存左上腔靜脈Ib型，CNV-seq分析提示5號(hào)染色體p15.33處缺失4.42Mb區(qū)域，主要涉及SLC9A3、SDHA等基因。

3 討 論

本研究中，181例 CHD 胎兒進(jìn)行了染色體核型分析及CNV-Seq分析，G顯帶核型分析顯帶水平為320-400條帶，可以較準(zhǔn)確地檢測(cè)大于10Mb的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常，染色體核型分析異常染色體檢出率為11.0%(20/181)。而通過(guò)CNV-Seq分析技術(shù)，有明確臨床致病意義的染色體畸變?yōu)?5.5%(28/181)，臨床意義不明確的為3.8%(7/181)。染色體核型分析正常的CHD致病性CNV檢出率5.0%(8/161)。鄧璐莎等[4]研究57例胎兒先天性心臟發(fā)育異常的病例中，NGS測(cè)序檢查出CNV結(jié)果異常的為19.30%；Zhu等[5]對(duì)115例CHD 胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，18.3%(21/115)的致病性CNV被檢測(cè)出。Jansen FA等[6]一項(xiàng)meta分析表明染色體核型正常的CHD胎兒額外檢出的致病性CNV為7.0%。這些研究均表明，CHD除了與常見的染色體非整倍體如21-三體等相關(guān)外，與染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān)，CNV-seq技術(shù)可以提高胎兒CHD染色體異常的檢出率。2019年我國(guó)專家共識(shí)[7]推薦CNV-Seq技術(shù)作為產(chǎn)前診斷的一線技術(shù)。因此，對(duì)胎兒CHD進(jìn)行產(chǎn)前診斷，染色體核型分析方法分辨率有限，不能檢出10Mb以下染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常，而CNV-seq技術(shù)可作為補(bǔ)充染色體核型分析的有效技術(shù)，提高胎兒CHD染色體畸變的檢出率，有助于臨床醫(yī)師進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

在本研究中，CNV-seq分析檢出8例致病性 CNV，片段大小為1.7-11.42Mb，均含有致病性基因。最常見的為22q11.2微缺失，涉及TBX1、CDC45L等多個(gè)致病基因，而TBX1基因是22q11.2微缺失綜合征大部分臨床表型的分子病理基礎(chǔ)，是圓錐動(dòng)脈干畸形最常見的綜合類型[8]，這些遺傳綜合征型的CHD胎兒出生后還可表現(xiàn)為智力障礙、生長(zhǎng)發(fā)育異常等多種功能障礙，而胎兒時(shí)期，CHD只是這其中表型之一。遺傳綜合征型的CHD涉及多個(gè)致病基因，嚴(yán)重影響胎兒CHD的預(yù)后，對(duì)家庭及社會(huì)都是一種沉重的負(fù)擔(dān)。對(duì)胎兒CHD進(jìn)行致病CNV的研究，對(duì)評(píng)估胎兒的預(yù)后有重要的意義。雖然CNV-Seq是分析基因組拷貝數(shù)變異的高分辨率檢測(cè)工具，從速度、自動(dòng)化程度、極少的樣本量、覆蓋面和分辨率上都比傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法有很大程度的提高。但是CNV-Seq分析也有局限性，不能有效測(cè)出基因組平衡的染色體倒位及易位、不能檢測(cè)一些特殊的三倍體及一些低比例嵌合體、檢出意義不明的CNV(variants of Unknown significance，VUS)等。VUS是CNV-Seq檢測(cè)胎兒CHD的額外發(fā)現(xiàn)，CNV-Seq技術(shù)在胎兒CHD產(chǎn)前診斷的應(yīng)用給臨床帶來(lái)最大的困難也就是VUS的解釋。

綜上所述，運(yùn)用CNV-Seq技術(shù)對(duì)胎兒CHD進(jìn)行產(chǎn)前診斷，較傳統(tǒng)的染色體核型分析方法能顯著提高染色體畸變的檢出率,鑒定疾病相關(guān)性CNV，為進(jìn)一步了解CHD的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，也為CHD的早期診斷、治療和遺傳阻斷提供臨床證據(jù)。