百草枯引起大鼠肺纖維化研究進展

楊珣 饒珊珊 張湘燕,3△

1.遵義醫科大學研究生院,貴州 遵義 553000；2.貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科,貴州 貴陽 550002；3.貴州大學醫學院,貴州 貴陽 550025)

百草枯(PQ)作為一種有效的除草劑,已廣泛應用于農田和牧場,具有顯著的除草效果。百草枯化學名稱為1-1-二甲基-4-4-聯吡啶陽離子鹽,對人體有很強的毒性[1],特別是在口服中毒情況下,由于無有效的治療手段,死亡率高達90%[2]。臨床病例顯示,PQ可導致多個器官損傷,特別是肺損傷,PQ可引起肺泡上皮損傷甚至死亡,隨著肺泡細胞的破壞,進一步出現肺毛細血管破裂導致肺泡內出血和肺部感染,最后發生肺纖維化[3]。目前PQ引起死亡的機制已初步闡明,但是 PQ引起肺纖維化的機制并沒有澄清。利用大鼠建立百草枯模型穩定可靠,比較符合百草枯致人肺纖維化病理特點。我們綜述了百草枯致大鼠肺纖維化的研究現狀,以期對為闡明百草枯致肺纖維化的發病機制提供參考,并為后續治療提供方向。

1 百草枯致大鼠肺纖維化發病機制

1.1肺泡損傷 大量實驗[4-6]顯示,按照百草枯15 mg/Kg劑量進行大鼠肺纖維化模型構建,效果較好,觀察PQ染毒大鼠肺組織病理變化,發現肺纖維化的發生主要有3個環節:肺泡的免疫和炎癥反應—肺實質損傷—受損肺泡修復和纖維化。許多肺部疾病均可導致肺纖維化重塑,肺損傷的起源尚不清楚,但肺泡上皮II型(AE2)細胞在肺纖維化中起著關鍵作用,它們對上皮細胞再生、肺泡穩定和與成纖維細胞相互作用有重要影響,而這些被認為是膠原沉積的原因,最終引起肺泡上皮持續損傷、再生能力受損、肺泡塌陷,導致肺纖維化[7]。

1.2氧化損傷 百草枯中毒造成的肺損傷主要與活性氧、過度脂質過氧化反應所產生的脂質過氧化氫物及谷胱甘肽含量減少有關。百草枯中毒時,百草枯與NAD(P)H在NAD(P)H氧化酶作用下,生成百草枯基團和NAD(P)+,同時氧被還原成超氧陰離子。肺上皮細胞胞漿中具有較多的對二苯基敏感的NAD(P)H:百草枯氧化還原酶,此酶在NAD(P)H存在情況下,利用氧,生成百草枯亞基團,導致肺損傷。在細胞中提取的百草枯還原酶包含硫氧還原蛋白還原酶的活性,可以保護細胞不受氧化應激損傷[8]。提示氧化損傷是引起肺損傷致肺纖維化的重要因素。既往研究發現[9]：在大鼠百草枯中毒中,肺組織和BALF中的丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(HYP)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平都升高,SOD和GSH-PX活性降低；肺組織中TGF-β1、MMP-2、TIMP-1 mRNA也升高。其他研究也發現,百草枯中毒大鼠血清新喋呤水平與LDH活性、肺丙二醛、TGF-β1及肺損傷程度相關,再次證實氧化應激、抗氧化能力降低和炎癥在百草枯誘導的肺損傷中起到重要作用,同時提示新喋呤水平升高程度可能成為百草枯中毒的一個預后評估參數[10]。實驗證明PQ中毒后2h內TSP-1、CD 47表達與肺組織中活性氧(ROS)、羥自由基、丙二醛及肺泡炎癥程度呈正相關,PQ中毒后1d TSP-1、CD 47表達與肺組織羥脯氨酸濃度呈正相關,提示TSP-1和CD 47的表達與氧化應激有關,進而導致大鼠肺泡炎及肺纖維化的發生發展[11]。

1.3內質網應激 研究發現百草枯暴露于體外和體內,會導致線粒體DNA(mtDNA)損傷及線粒體功能障礙,mtDNA以無堿性位點的形式受損,受損原因與氧化損傷相關[12]。有研究[5]發現,百草枯中毒大鼠肺組織α-SMA、糖原相關蛋白78(GRP78)表達上調,提示內質網應激在百草枯中毒大鼠肺纖維化中起到重要作用。盡管哺乳動物細胞對內質網應激誘導的細胞凋亡(未折疊蛋白反應)有防御機制,但百草枯中毒改變了未折疊蛋白相關分子的表達水平,導致在人肺上皮A549細胞中發生內質網應激相關細胞死亡,而牛磺熊去氧膽酸鈉(TUDCA)能夠減輕百草枯誘導的內質網應激而抑制細胞死亡,減輕肺損傷[13]。

1.4信號通路 PQ染毒的大鼠肺組織中TGF-β1明顯升高,研究已經表明TGF-β1/Smads 信號通路的激活在PQ 引起的肺纖維化發病中具有十分重要的作用[14]。除此之外,上皮間充質轉換(EMT)被認為參與了百草枯(PQ)誘導的肺纖維化過程,但這一過程的分子機制尚未明確。研究發現PQ誘導的上皮RLE-6NT細胞發育間充質細胞特征,上皮標記物E-cadherin顯著減少,細胞外基質標記物α-平滑肌肌動蛋白呈劑量和時間依賴性增加。此外,PQ處理的RLE-6NT細胞具有EMT樣表型,MMP-2、MMP-9、COL I和COLⅢ表達增高,遷移能力增強,這些都導致肺纖維化的發生,而PQ誘導的EMT通過激活MAPK通路導致erk-1和smad2磷酸化,表明PQ誘導的肺纖維化是通過由MAPK途徑介導EMT發生的。MAPK通路可能是肺纖維化發生的原因,且是肺泡上皮細胞的一個有前途的治療靶點[15]。

1.5其他細胞因子 PQ染毒大鼠中,結締組織生長因子(CTGF)表達增加, CTGF是一種重要的生長因子,參與組織修復和纖維化的發生,可以觸發肺成纖維細胞的增殖、遷移,誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞分化,引起α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原的表達增加,提示 CTGF可能在PQ誘導的肺纖維化中起重要作用[16]。同樣觀察到在隨PQ中毒大鼠肺纖維化進程中,整合素連接激酶(ILK) 的mRNA和蛋白表達增加,ILK在肺纖維化形成中可能起著重要作用[17]。上述研究提示CTGF、ILK可能是PQ中毒致肺纖維化的關鍵分子靶點。

2 抗纖維化治療進展：

2.1血管緊張素II的抑制 氯沙坦是一種血管緊張素II 1型受體拮抗劑,對纖維化的治療有積極作用。有實驗探究了氯沙坦對PQ中毒大鼠肺纖維化的影響,發現氯沙坦能顯著降低PQ染毒鼠肺組織中羥脯氨酸含量和下調TGF-β1、MMP9和TIMP-1的mRNA和I型和III型膠原的表達。PQ組大鼠的組織學檢查顯示肺損傷和肺泡間隙廣泛的炎性細胞浸潤和肺纖維化,而氯沙坦可明顯減輕這種損傷并預防肺纖維化。結果表明,氯沙坦能減輕肺損傷,預防肺纖維化[18]。而這種抗纖維化作用可能是因為血管緊張素II的抑制[19]。以往的研究[20]表明,從中藥丹參中分離得到的活性化合物丹參酮IIA (TiIA)能有效地減輕博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化,然而,Tiia是否能減輕百草枯(PQ)所致的急性肺損傷(ALI)尚未確定。PQ可引起BALF組織學改變,增加中性粒細胞浸潤、肺濕/干重比、細胞總數、蛋白含量和LDH水平,同時顯著降低肺組織ACE 2和Ang-(1-7)的表達水平,研究表明 Tiia減弱了這些作用,提示Tiia可能對PQ誘導的大鼠ALI有治療作用,ACE 2和Ang-(1-7)可能參與了這種作用的機制。

2.2過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ(PPAR-γ) PPAR-γ是一類配體激活的核轉錄因子超家族成員,在炎癥的發生中有著重要的調節作用。羅格列酮是一種PPAR-γ激動劑,能恢復PQ引起的動脈血氧分壓(PaO 2)下降、濕干(W/D)肺組織重量比(W/D)升高和肺纖維化評分,抑制PQ誘導的PPAR-γ和α-SMA蛋白和mRNA水平的降低。提示羅格列酮通過上調PTEN和下調轉化生長因子-β1的表達,以PPAR-γ依賴的方式減輕PQ誘導的肺纖維化[21]。阿托伐他汀是一種PPAR-γ受體拮抗劑,除具有降膽固醇作用外,還具有抗炎和抗氧化的作用。有學者使用阿托伐他汀治療百草枯染毒的大鼠,測定血清丙二醛(Lung hydroxyproline)和肺指數及半定量組織病理學變化。發現阿托伐他汀對百草枯誘導的大鼠肺纖維化有良好的預防作用,而它同樣通過拮抗PPAR-γ降低TGF-β1表達水平,從而在百草枯中毒中起到了的抗纖維化作用[22]。以上研究提示PPAR-γ的研究可能為治療肺纖維化帶來新的方向,其機制可能與PPAR-γ拮抗劑拮抗TGF-β1的表達有關。

2.3中藥抗炎、抗氧化治療 百草枯致肺纖維化暫無有效治療方法,其中中藥治療是目前一種治療手段。已證明依達拉奉可通過抗氧化的方式減輕肺纖維化,研究者對比了銀杏葉二萜注射液(DGMI)和依達拉奉對百草枯(PQ)所致大鼠肺損傷和肺纖維化的影響。結果發現DGMI可以降低PQ中毒大鼠白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,逆轉肺組織中丙二醛(MDA)水平的升高和超氧化物歧化酶(SOD)水平的下降,顯著提高PQ中毒大鼠的存活率,治療效果更好[23]。黃芪總黃酮(FAC)也可以改善血清中的抗氧化酶活性,減輕纖維化程度和纖維化程度。FAC可能是通過抑制TGF-β/SMAD信號通路減輕了PQ誘導的大鼠肺纖維化[24]。姜黃素為二酮類化合物,具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用,有研究者使用姜黃素治療百草枯染毒的大鼠,發現治療組大鼠PaCO 2、血清Smad 4、Smurf 2和IL-4均低于百草枯組,證明姜黃素能減少PQ中毒大鼠肺組織膠原纖維沉積,有效改善百草枯中毒大鼠的肺纖維化[25-26]。也有研究發現七葉皂甙鈉[27]、冬蟲夏草[28]可通過抗炎作用減輕肺損傷。

2.4苯丙胺類興奮劑 苯丙胺類興奮劑可減輕PQ中毒所致的肺損傷和肺纖維化。這種效應是劑量依賴性的。ATS治療可通過增加上皮標記物E-cadherin和ZO-1的水平,降低肺組織和體外細胞培養中間充質標記物α、SMA和波形蛋白的表達而減輕EMT的發生。此外,苯丙胺類藥物在體內和體外還可能降低HIF-1α和β-catenin的水平。因此苯丙胺類興奮劑可減輕PQ誘導的肺纖維化的機制可能與下調缺氧缺血性腦病(HIF-1)α/β-catenin通路和抑制苯丙胺類興奮劑(ATS)誘導的EMT有關,苯丙胺類興奮劑可作為治療PQ中毒所致肺纖維化的藥物[29]。

2.5亞氧苯胺羥肟酸(Saha) 最近的研究表明,組蛋白去乙酰化酶抑制劑亞氧苯胺羥肟酸(Saha)具有抗纖維化作用。但其抗纖維化的確切機制尚不清楚。我國學者發現SAHA通過抑制TGF-β1誘導的HDAC1活性來阻止Smad7的去乙酰化,提高Smad7蛋白水平,加強Smad7 TGF-β1/Smads信號通路的負調控作用,從而發揮抗纖維化作用[14]。

2.6吡非尼酮和強的松 吡非尼酮可減輕PQ誘導的肺纖維化,經過吡非尼酮治療的PQ染毒大鼠肺組織羥脯氨酸含量、轉化生長因子-β1和腫瘤壞死因子-α水平減低,吡非尼酮還能抑制PQ誘導的MMP-2和TIMP-1的增加,提示吡非尼酮通過調節大鼠肺纖維化過程中羥脯氨酸含量、氧化應激、促炎、促纖維化基因表達發揮抗纖維化作用。有意思的是,該實驗對比了強的松的治療效果,發現單用強的松并無抗纖維化作用,而當吡非尼酮與強的松龍合用時,所有上述的這些作用都被夸大了,表現出更強的治療作用[30]。

3 結 語

百草枯中毒致肺纖維化的發病機制目前尚未闡明,但經過眾多研究者努力,已取得了部分進展,用大鼠建模用于實驗是較為廣泛、可靠的方法,在此基礎上,出現了許多新的百草枯致肺纖維化的治療方向,但仍處于實驗階段,無突破性進展。然而百草枯農藥中毒導致肺纖維化是臨床常見病例,預后差,是目前研究的難點、重點,還需要大量研究者繼續努力探索解決。