結核疫苗的研究現狀與進展

曹穎 綜述 張湘燕△ 張翊玲 審校

(1.貴州醫科大學研究生院，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫院呼吸內科，貴州 貴陽 550004)

近年來，結核病成為傳染病中的“頭號殺手”，雖然結核病的診療不斷標準化，但是全球結核病的控制情況仍不容樂觀。如果在早期病程中應用合理的干預措施，可能會得到有效控制，為此就目前結核疫苗研究進展及現狀作一綜述。

1 研究背景及現狀

1.1研究背景 近年來，結核病已成為傳染病“頭號殺手”。據WHO統計，全球已有近1/3人口約20億人感染結核分支桿菌，結核病患者達到2 000萬名[1]。95%的結核感染被認為是以無癥狀的潛伏形式存在[2]。肺結核常發生在貧窮、邊緣和社會地位低下群體和社區，包括營養不良、免疫力低下、流離失所、監禁、腸道寄生蟲普遍感染的地方和特定少數民族的人群[1-2]。雖然大部分感染者體內結核桿菌都處于抑制狀態，但還是有大約10%的幾率會“蘇醒”過來，造成各種結核病變[1]。目前使用最廣泛的結核疫苗被稱為卡介苗(BCG)，于1921年開發，在結核病高發國家被常規用于嬰幼兒、兒童急性粟粒性肺結核與結核性腦膜炎等嚴重疾病的預防。應用至今已有90多年，為結核分枝桿菌的“近親”—牛型結核分枝桿菌(M.bovis)進行多次傳代培養，得到了減毒的活性結核分枝桿菌疫苗—卡介苗[3-4]。這款疫苗為全球應用最廣泛、使用最多的結核疫苗，雖然新生兒接種卡介苗效果肯定，但對多數成人肺部疾病的預防作用不一，有的幾乎無效，防治效果差異顯著。雖然卡介苗能預防原發性結核病，但對已感染結核分枝桿菌卻束手無策。全球已采取綜合措施有效的控制90%結核分枝桿菌感染人群，但其中10%仍將發展成為活動性疾病，給全球帶來了嚴重的疾病壓力及巨大醫療和經濟挑戰[5-6]。

1.2正確評價和認識卡介苗的免疫保護力 卡介苗本身為牛型結核分枝桿菌減毒株，其免疫效果一方面受環境分枝桿菌的影響，一方面經反復傳代培養和保存導致保護性抗原不同程度丟失，與HRv株比較，在傳代培養過程中，丟失了大量的抗原基因即缺失16個區域( RD1～RD16)，共包括129個開放閱讀框[7]。RD1區在所有的卡介苗中都缺失；其中RD3～RD7、RD9～RD13區域在牛分枝桿菌中發生缺失；RD2、RD8、RD14、RD15、RD16區域在不同子代卡介苗出現缺失。RD1區9個基因全部丟失，基因包括Rv3871～Rv3879。在形成卡介苗的毒力衰減過程中，基因缺失是重要原因之一[7]。ESAT6、CFP10是RD1區核心的T細胞抗原，能誘導產生免疫應答。有研究[8]表明敲除RD1基因，可以降低結核分枝桿菌的毒力。目前研究最多的為RD1區基因編碼的ESAT-6[9]，能誘導強烈的T細胞免疫反應，檢測ESAT-6抗原特異性反應也是一個非常有價值的診斷方法，它是一種分泌型蛋白，其功能未知，由于BCG缺失ESAT-6，可利用此種抗原來鑒別為卡介苗接種還是結核分支桿菌感染。由于ESAT-6特異性反應強，可用于鑒別結核是否處于結核早期(感染早期)還是潛伏期或亞臨床期[9]。由于環境因素與卡介苗傳代等因素影響，卡介苗菌株的遺傳特性發生變化，導致卡介苗本身的不足與局限性。正確認識卡介苗的遺傳特性，對研究新型結核疫苗具有指導意義。

1.3結核耐藥情況 本世紀初以來，由于卡介苗的廣泛應用及各種抗結核藥物的問世，抗結核治療取得了突破性進展。然而，多重耐藥結核桿菌(MDR-TB)、廣泛耐藥結核桿菌(XDR-TB)以及完全耐藥結核桿菌(TDR)的出現，對全球結核病的控制帶來了新的挑戰與威脅。耐藥結核病發生與大多數結核病流行國家藥敏試驗的實驗室設施不足相關，而實際的全球耐藥結核病例數尚待估計[4]。在2008年大約44萬例多重耐藥結核發生，只有7%的人被鑒定并報告給世界衛生組織。這些病例中，只有五分之一是按WHO標準治療[1]。MDR和XDR結核的治療可以采用現有的診斷技術和藥物，但療程大大延長，同時費用更加昂貴及治療難度增加，對于很多發展中國家的患者是難以承受的，長療程用藥其依從性也存在困難。隨著結核桿菌耐藥性的增加抗結核治療的難度越來越大，嚴重威脅著人類健康。在結核耐藥方面需進一步加強研究與探索，以尋求突破。

1.4結核分枝桿菌感染不同生長階段表達不同的抗原 結核分枝桿菌感染的不同時期如早期、晚期、潛伏期，因生長階段不同所表達的抗原也是不同的，而卡介苗在不斷地傳代過程中存在缺陷所以導致相關的生長階段缺乏相應的保護性抗原編碼的基因，所以不能產生免疫保護作用(相應的免疫保護作用)[10]。如今潛伏期感染的結核是全球抗結核治療最大的挑戰，治療潛伏性結核感染(LTBI)需要很長化療周期(9個月)，使治療依從性極困難。有研究[11]表明聯合使用早期抗原與晚期/潛伏期抗原可大大提高疫苗的免疫原性，引起很好的免疫保護，類似的很多研究均支持這一結論。南非的L.Govender等[12]研究與肺結核疾病比較，人類在潛伏感染中結核潛伏相關抗原Rv 2660和Rv 2659對CD4+ T細胞的反應更強。T.Stephen等[13]研究重組的卡介苗表達抗原Rv2659c、Rv3407和Rv1733c能協同提高老鼠模型的脾肺遠期療效，所得的數據表明重組卡介苗所表達的結核分枝桿菌潛伏相關抗原能提高對結核分枝桿菌免疫力與保護性。R.Virginie等[14]研究了結核分枝桿菌DNA疫苗及被結核感染的小鼠其八種休眠調節編碼蛋白的免疫原性，包括Rv1733c、Rv1738、Rv2029c(pfkB)、Rv2031c/hspX(acr)、Rv2032(acg)、Rv2626c、Rv2627c與Rv2628，這些抗原除了Rv1738外均能引起較強的體液和/或細胞Th1型(IL-2和IFN-γ)免疫反應。D.Goletti等[15]研究的潛伏期抗原Rv2628與治愈的肺結核及遠期感染相關，在遠期感染中Rv2628反應是近期感染的5倍。由于卡介苗由于在傳代培養過程中，使其丟失了大量的基因，因此存在很大的免疫缺陷。結核分枝桿菌感染不同生長階段其編碼不同時期抗原的基因及其重要，能對機體產生免疫保護作用。

2 目前候選疫苗的免疫機制(結核桿菌感染機體的免疫機制及保護性細胞因子分析)

目前的候選疫苗尤為關鍵的免疫機制是引起Th1細胞的刺激從而激活巨噬細胞的抗分枝桿菌能力，記憶性T細胞產生多種細胞因子參與免疫反應。不同的T細胞群參與結核病的免疫反應。至關重要的是CD4 T細胞產生1型細胞因子，特別是IFN- γ，與腫瘤腫瘤壞死因子(TNF)[16]。這些1型輔助性T細胞(Th1細胞)激活巨噬細胞，抑制細胞內的結核分枝桿菌的。因此，它是結核病的最為重要的免疫保護方式[17]。CD4 T細胞被組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類基因產物—抗原肽刺激，結核分枝桿菌優先定植在自噬體里有利于主要組織相容性復合體MHC II類處理。CD8+T淋巴細胞產生的細胞毒性分子，如穿孔素，顆粒溶素和顆粒酶，它們不僅能裂解宿主細胞，而且也直接殺死結核分枝桿菌。Th17細胞可能在結核桿菌在早期階段為單核細胞和Th1淋巴細胞進入并形成肉芽腫奠定免疫保護的基礎。然而過度的Th17細胞刺激，會導致中性粒細胞和炎癥細胞的過度表達引起損害。有證據顯示[18]Th2細胞在結核分枝桿菌感染后，產生IL-4和IL-5，這些細胞因子能刺激B淋巴細胞產生抗體，由于Th2細胞能反調節Th1細胞，它們可能會損害抗結核的免疫保護。調節性T細胞(Treg)主要的生物學功能是控制或抑制免疫反應。Treg的活化會導致過早的免疫抑制，Treg和其他免疫調節方式一樣如T細胞耗竭，將有助于肺結核疾病的復發與激活。在慢性感染性疾病中，Treg抑制炎癥反應限制組織損傷，可以利用Treg的誘導活性作為疫苗免疫的最佳誘導效應[19]。目前的候選疫苗僅能減少初始細菌感染，不能消滅病原體，僅能預防疾病。事實上，疫苗免疫(免疫反應)應該包含肺結核從增生活躍到停止與休眠的各個階段。因此未來的疫苗接種策略應將加大免疫學方面的探討與認識。

3 結核疫苗研究情況

10年前，只有為數不多的幾個結核疫苗產品在開發，現在已經有十幾個了，由于卡介苗自身存在缺陷與不足，對成人預防效果不一[1]。但該疫苗應用90余年，對嬰幼兒的結核防治作用肯定。新疫苗的療效評價需要仔細的分析和試驗來盡可能地檢測其安全性[4]。一般而言，第一代候選疫苗大致可以分為兩種，第一種是指可以完全取代卡介苗；第二種是提高卡介苗保護效果的加強劑。與此同時，科學家們正致力于一種治療型疫苗研究，就是通過激活人體免疫系統，清除體內潛伏感染的結核桿菌[9-11]。肝素結合血凝素(HBHA)是一個有趣又有挑戰性的候選疫苗，疫苗的保護價值在于對潛伏感染病人具有免疫原性。HBHA疫苗刺激卡介苗誘導的保護作用。因為蛋白質是高度甲基化，這種結構使得它很難在一個不相關的表達系統產生蛋白質的重組。我們常指的是預防性疫苗，主要針對于預防。而治療性疫苗主要指疾病的治療?，F今研究的疫苗大多集中在治療性疫苗，但主要局限于小鼠研究。根據結核病疫苗的種類可以分為全菌疫苗(包括減毒活疫苗和全菌失活疫苗等) 和亞單位疫苗( 包括蛋白質/多肽、DNA疫苗、以病毒為載體的重組疫苗等)；但目前尚無一種候選疫苗的保護性和持續性優于卡介苗[1-4]。隨著相關疫苗的進一步理解與深入，每種疫苗都各有特點與優勢，同時又存在一定的缺陷與不足。

4 新型TB疫苗的研發現狀

4.1亞單位疫苗 由一種或多種MTB蛋白組分與免疫佐劑聯合應用而成的疫苗。亞單位疫苗是將致病菌主要的保護性免疫原存在的組分制成的疫苗。此類疫苗能通過一種或者幾種保護性抗原刺激產生有效的免疫反應。該疫苗具有以下特點：安全性高；純度高，穩定性好；產量高；用于有免疫病理作用的，或病原體難于培養疫苗研究[1-5,20]。亞單位疫苗易于被人們接受，不過需要對免疫佐劑做更深入的探索研究。使用蛋白質多肽疫苗主要考慮抗原的選擇和佐劑的應用，將多個抗原融合表達，有助于提高疫苗的免疫保護效率。

4.2佐劑 使用蛋白質/多肽疫苗主要考慮抗原的選擇和佐劑的應用，只有有效的佐劑輔助才能產生理想的免疫應答。不同的免疫佐劑可以引起Thl或Th2型不同的免疫反應[20]。亞單位疫苗易于被人們接受，不過需要對免疫佐劑做更深入的探索研究，避免終生應用佐劑來保持亞單位疫苗的免疫性。

4.3重組卡介苗疫苗 卡介苗是牛型結核分枝桿菌的減毒株，與人型致病的結核分枝桿菌基因組比較，缺失129個編碼基因，重組卡介苗是對卡介苗本身進行改造，彌補卡介苗的缺陷，使其能夠表達MTB的某些重要抗原來增強卡介苗的免疫原性[19]。此外，在卡介苗中重組表達干擾素和IL-12等細胞因子，可以增強卡介苗誘導細胞免疫反應的能力，促進免疫反應向Thl型轉化，具有重要的免疫調節作用[21]。雖然rBCG30保護力超過其它的候選疫苗，但是否存在其它影響該疫苗免疫保護的未知因素我們還不得而知，需繼續加以觀察與研究；其生物安全性仍需進一步分析與深入研究[22]。

4.4重組活載體疫苗 重組活載體疫苗應用無病原性或弱毒疫苗株細菌和病毒，例如卡介苗分枝桿菌和沙門氏菌弱毒疫苗株、痘病毒等作為載體，插入外源性保護基因，構建重組活載體疫苗[23]。首先要確保作為載體的微生物對機體是安全的，同時要求各成分之間一般不發生相互干擾或排拆現象，并在體內持續表達結核特異性抗原，載體本身具有佐劑的作用，因此產生強烈的T細胞免疫反應，免疫保護效果更強，該類疫苗常應用于加強免疫中，其開發和應用前景較好[24]。重組活疫苗利用安全的微生物將抗原送入體內發揮相應的作用，載體本身就具有免疫佐劑的作用等優勢，值得我們進一步深入研究與探討。

4.5DNA疫苗 DNA疫苗，又稱“裸”DNA疫苗、基因疫苗，核酸疫苗等相關名稱。DNA疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因重組于真核表達元件，構成重組質粒DNA，通過各種方法將質粒導入機體，使外源基因在活體內表達，產生免疫反應[25]。DNA疫苗具有以下優點：DNA導入的載體(如質粒)其結構簡單，生產成本較低；DNA疫苗制作與更新方便容易；外源基因在體內能夠持續刺激產生持久的免疫應答；不同抗原基因的質?？梢酝瑫r聯合免疫；可以混合多種生化特性類似的質粒DNA；DNA疫苗不用加佐劑，成本低；基因疫苗在接種后，可以誘導產生細胞和體液免疫；DNA分子很穩定；毒性逆轉的可能性不大；質粒載體可以反復使用[26]。然而DNA疫苗尚未得到廣泛的應用，因為DNA疫苗涉及到如何應用抗原、佐劑、及DNA本身的生物安全性等問題，而安全問題則是人們對它的最大顧慮。結核病DNA疫苗既能成為預防性疫苗，還可以成為治療性疫苗。DNA疫苗的優點多于其他一切疫苗。但DNA疫苗最大缺陷就是對較大哺乳動物缺乏免疫原性[25]，因此，如何提高DNA疫苗的免疫效力仍需要繼續研究與進一步探討。

5 當前困境與展望

雖然隨著WHO推薦的肺結核診斷和治療的標準化的方法廣泛應用，在1995和2008之間超過3600萬人被治愈的，避免了600萬人死亡，然而全球結核病控制是遠遠沒有完成。結核病仍然嚴重威脅全球公共健康，幾個關鍵的挑戰依然存在，如技術診斷、治療落后和不充分的預防[1-6]。多重耐藥(MDR)結核病仍是一個嚴重的威脅。慶幸的是，現有的藥物療法可以治愈大多數的患者，如果在早期病程中應用合理的干預措施，可有效降低傳播率、防止疾病蔓延[1-4,20]。加強結核病例發現，感染控制，和異煙肼預防性治療聯合對艾滋病毒相關的結核病防治，通過個體的免疫重建和降低HIV的傳播引起結核病發病率短期和長期的下降[5,26]。雖然2050年消除肺結核作為一個全球性公共健康問題的長期遠大目標，只有通過新的干預措施和發展新型疫苗，才可以實現這一重大貢獻。