活體共聚焦顯微鏡在微生物性角膜炎診斷中的應用進展

呂 健，曾思明，蔣 莉，李蘭建，徐 帆

0引言

微生物性角膜炎(microbial keratitis,MK)是全球引起角膜盲的主要眼病之一[1-2]。在發展中國家因MK導致的單眼失明高達(150～200)萬人/a，預防視力永久性喪失的關鍵在于早期準確的病原學診斷從而實現早期精準治療。角膜刮片微生物培養是目前診斷MK病因的金標準，但存在取材帶來醫源性損傷、病原體培養周期長、培養的陽性率低等許多缺點[3-4]。活體共聚焦顯微鏡(invivoconfocal microscopy,IVCM)作為一種非侵入性成像技術[5-8]，可實時提供清晰的角膜各層圖像，對角膜疾病診斷和隨訪起到不可替代的作用[9]。但由于儀器在檢查會產生大量的圖片，使醫生診斷負擔加重，診斷準確性下降。近年來，人工智能(artificia intelligence，AI)已被廣泛應用于輔助醫生通過共聚焦圖片診斷角膜炎，并表現出一定的優越性[10-11]。

1活體共聚焦顯微鏡在MK診斷中的應用

1.1真菌性角膜炎迄今為止，在全球已經發現大于70種可引起角膜感染的真菌[12]。在以工農業為主而醫療條件有限的發展中國家中，真菌性角膜炎(fungal keratitis，FK)是導致國民單眼失明的主要原因[13]。早期識別真菌病原體并提供有針對性的治療可以降低嚴重并發癥的發生率。通過IVCM圖像可直觀地觀察菌絲、孢子，以及菌絲在角膜基質內的生長方式，是診斷FK的重要手段[14]。

IVCM中菌絲通常表現為高反光的紊亂線形結構，曲霉和鐮刀菌長度約在200～400μm，但菌種的不同其分支或分節也不同，如：曲霉菌絲直徑5～10μm，呈45°分枝成兩段；而鐮刀菌則多以90°分枝。酵母如白色念珠菌表現為卵形芽殖體，長10～40μm，寬5～10μm，并有可能發展成假菌絲[15-16]。Das等[17]研究結果表明，IVCM在早期診斷深部FK的敏感性為83%。Kanavi等[18]對133例感染性角膜炎的病例進行研究，發現IVCM的敏感性為94%，但通過涂片和培養檢查，真菌性角膜炎的檢出率僅分別為20.3%和12.0%。Winchester等[19]觀察了FK治療過程中角膜的變化，發現經過嚴格治療4d后，這些細長的纖維減少并轉變為短的白色纖維，繼續治療3wk后菌絲變為直徑5～10μm類似于反應細胞的高反光的圓形腫塊，最終高反光的圓形結構完全消失。有研究使用IVCM對121例真菌性角膜炎患者抗真菌治療過程進行監測，隨著病情的好轉，IVCM可以觀察到患者菌絲密度和炎性細胞數量逐漸減少，角膜基質細胞恢復良好[20]。

綜上所述，醫生可以通過IVCM可視化菌絲和類菌絲結構從而做出診斷，對治療期間角膜組織的損傷與修復進行實時地觀察，對評估FK的治療效果和選擇手術時機有重要的指導意義[18-21]。IVCM還可用于深部角膜真菌感染的檢測，是FK的重要診斷工具。盡管IVCM具有許多優點，但仍然存在一些限制，例如需要熟練的操作員或經驗豐富的醫生，檢查時需要患者的配合，角膜瘢痕會嚴重干擾檢查結果。

1.2棘阿米巴角膜炎棘阿米巴角膜炎(acanthamoeba keratitis，AK)是一種因棘阿米巴原蟲感染導致的具有潛在破壞性的角膜潰瘍。常表現為單眼發病，伴異物感、畏光、流淚，以及與體征不符的劇烈疼痛，未及時治療常并發角膜穿孔。避免引起嚴重的并發癥關鍵在于早期準確診斷及治療[22-23]。但棘阿米巴角膜炎早期的臨床表現缺乏特異性，易延誤治療[24]。微生物培養作為診斷AK的金標準，但存在培養周期長、陽性率低(0～68%)的缺點[25-26]。

IVCM在棘阿米巴病原體表現為休眠期的包囊和活動期的滋養體兩種形態[16]。在1994年有文章首次報道了通過使用IVCM觀察到AK時出現放射性角膜神經炎以及疾病后期基質內形成空腔，揭開了共聚焦成像技術可以應用于AK診斷的面紗[27]。后期大量的文獻指出棘阿米巴包囊常出現在角膜上皮層及基質層，其表現為直徑15～28μm，球形、圓形、卵球形、梨形或呈雙壁狀超反射結構[28-32]。滋養體在IVCM圖像中表現為大小15～100μm、形態不規則的高反光結構[33]。Chew等[27]認為滋養體大小為15～100μm且周圍被低反射的基質包圍的高反射結構。也有學者將滋養體描述呈線狀結構[33]。自2004年以來，很多研究強調了IVCM作為AK有效診斷工具的作用[33-35]。在Kanavi等對133例感染性角膜炎研究的文章中，指出IVCM在診斷AK的敏感性為100%和特異性為84%[28-36]。因該項研究的對照組是利用角膜刮片進行病原學培養，其結果會受深層感染的樣本數量的影響，可信度有待考量。Tu等[36]使用IVCM對125例懷疑患有AK的患者進行檢查，其診斷檢測靈敏度范圍為90.6%～92.9%，特異性范圍為77.3%～100%，證實了可以使用IVCM作為AK的診斷工具的結論。Matsumoto等[37]表明對AK患者角膜的重復IVCM檢查結果顯示，經規范化治療后4～6wk，滋養體和包囊開始消失。Babu等[38]使用IVCM監測聯合真菌和棘阿米巴角膜炎的治療，獲得了較好的效果。這些研究結論說明IVCM對角膜深層的棘阿米巴原蟲具有診斷作用，在評估疾病的治療效果具有重要潛力，是早期、快速地診斷AK的主要方法。

1.3單純皰疹病毒性角膜炎單純皰疹性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)在發達國家中是角膜盲的主要傳染性病因[39]。單純皰疹病毒潛伏于神經元及上皮中，易引起反復感染和炎癥，使上皮細胞和成纖維細胞溶解，最終形成角膜瘢痕[18]。HSK感染時IVCM下可在翼狀細胞層和基底細胞層見到活化的樹突細胞浸潤，而恢復期其密度降低，在深基質層瘢痕與正常角膜交界處還可觀察到眾多的微血管小枝，但并未描述病毒的具體形態。Cavanagh等[40]使用IVCM分析了1例慢性復發性皰疹感染的情況，與先前的皰疹病毒受累區域相比，復發后上皮細胞較正常上皮細胞變大，角膜基質層致密纖維化，并且在瘢痕區域上皮下神經叢缺失。Rosenberg等[41]描述使用IVCM對16例患單側HSV的患者進行觀察，其中11眼基底神經正常，有2眼基底神經缺失和3眼長神經纖維束的數量減少及在瘢痕區基底上皮細胞中高度反射的樹突狀結構，并被認為是活化樹突細胞。因此他們提出假設：圖像中見到朗格漢斯細胞可能對臨床醫生區分皰疹性角膜炎和細菌性角膜炎是有幫助的。2011年Toine等發現通過將裂隙燈與IVCM聯合使用，檢測到在35例患者中的14例共出現17次復發[42]，提示了IVCM檢查可以通過結合細胞水平的形態學評估和客觀角膜背向散射測量來增強炎癥活動的早期檢測。Müller等[43]使用IVCM觀察HSK后角膜瘢痕形成眼及對側臨床未受累眼發現：瘢痕眼以及對側眼角膜內皮細胞密度、總神經長度顯著低于健康對照組，推測單側HSK后雙側角膜神經受損神經肽水平降低、內皮細胞損失。可見，目前IVCM受限于像素原因，仍不能對病毒病原體進行直觀觀察[44]。但可以通過IVCM觀察和監測結構性HSV患者病情的變化，對其預后進行判斷，并起到與其他類型角膜炎鑒別診斷的作用。

1.4細菌性角膜炎細菌性角膜炎(bacterial keratitis，BK)的流行病學和微生物學特征常因地理情況有所差異，在溫帶氣候中細菌是傳染性角膜炎的致病微生物[45]。目前，診斷病原體常用的診斷方法仍然依靠角膜涂片和微生物培養，然而，陽性率僅為40%～60%。原因是細菌直徑僅為1～2μm，除具有特征性的結構或體積較大外(如諾卡菌屬)IVCM無法直接可視化病變組織中細菌病原體[15]。IVCM觀察BK時發現角膜翼狀細胞層和基底細胞層大量有圓球形和高反光的炎癥細胞浸潤，病灶周圍角膜基質細胞密度變大。發生潰瘍時角膜IVCM表現為組織缺損、水腫、厚度增加，白細胞和朗格漢斯細胞數目明顯增加，這為輔助診斷及預后提供重要信息[46-47]。Chew等[27]首次使用激光共聚焦顯微鏡對角膜基質層內注射蠟狀芽孢桿菌的BK的兔模型進行共聚焦成像，發現直徑約10μm的細菌在前基質內可表現為圓形的、細小的超反射結構。這些結構容易與纖維細胞和體積較小、反光明顯的白細胞區分。Kaufman等[48]使用IVCM觀察2例隱形眼鏡相關性金黃色葡萄球菌和草綠色鏈球菌感染的角膜炎患者的角膜，IVCM圖片中可見上皮水平以下1.5～2μm直徑的超反射圓形體，其有可能對應細菌，并通過其大小與球形超反射結構(淋巴細胞或粒細胞)區分。但這些高反射的圓形結構與細胞內結構碎片大小與形態相似，因此無法將其與細菌區分。Vaddavalli等[49]對3例有關諾卡氏角膜炎進行研究表明：諾卡氏菌是一種直徑小于1.5μm的分枝纖維狀細菌，IVCM圖像中可見高反射、短、薄的分支細絲，當存在其他類型的炎癥細胞浸潤時邊緣細絲變得更加明顯。可見，目前仍未能通過IVCM區分細小的細菌、炎癥細胞和組織細胞的碎片，僅可以觀察特殊類型的細菌病原體。但在治療期間使用IVCM對BK患者進行觀察，可以起到有效監測BK愈合情況的作用，并能通過炎癥細胞的浸潤情況，判斷角膜的嚴重程度，為治療提供線索。

2人工智能在自動識別IVCM圖像中的應用

AI是計算機科學的一個分支，是研究、開發用于模擬、延伸和擴展人的智能的理論、方法、技術及應用系統的一門新的技術科學，其中圖像識別與分析是人工智能的一個重要領域。隨著多學科融合發展，圖像分析技術被逐漸應用于醫學研究和臨床診斷領域，推動現代醫學診斷的深刻改革[50-51]。越來越多的學者利用AI對IVCM圖像解讀從而輔助醫生診斷角膜炎[10,52-53]。

2003年Saini等[53]根據角膜炎的病因構建的人工神經網絡模型在進行外部驗證時可以將43例角膜潰瘍中的39例正確分類。結果顯示構建的模型對細菌和真菌識別的特異性分別為76.47%和100%，分類的準確率為90.7%，顯著優于臨床醫師的診斷。2016年劉治團隊更是應用局部二元模式(local binary pattern，LBP)和支持向量機(support vector machne，SVM)模型，將200張IVCM圖像中的菌絲和正常角膜的神經纖維區分，準確率為93.53%[10]。2018年該團隊利用自適應魯棒二進制模型(adaptive robust binary pattern，ARBP)結合SVM的方法構建自動診斷算法框架，結果顯示在大約400幅圖像的數據集上實現了菌絲自動檢測的準確性為99.74%，靈敏度和特異性更是接近于100%。當ARBP結合SVM融入線段定量分析法后構建的具有自動識別菌絲并量化菌絲密度的深度學習模型，獲得了靈敏度為89.29%，特異性為95.65%。ROC曲線下面積為0.946的結果，該方法與角膜刮片結果相比具有良好的優越性[13]。

這些研究說明了AI在輔助醫生通過IVCM識別FK，提高準確性方面具有重要的意義。但是應用AI輔助診斷FK的優勢是顯而易見的：圖像自動檢測不依賴技術人員，并且可以幫助經驗不足的年輕醫生，通過提供及時、準確、客觀和定量地評價標準真菌性角膜炎。但目前這些研究的圖像數量少，通常來自一個醫療中心，單一的設備設置、圖片采集系統和人口特征可能會影響IVCM圖像的多樣性。

3展望

感染性角膜炎患者角膜變薄且疼痛明顯，IVCM檢查是一種接觸性檢查工具，操作過程易引起患者眼部不適，且IVCM的成像視野小，操作者須將探頭緩慢移動至整個感染區域，對于角膜邊緣感染性微生物或間接感染成像困難，因此更需要患者高度的配合才能采集清晰圖像和進行動態檢查。并且對于同一患者感染期間跟蹤角膜內細胞變化或進行隨訪檢查時，對相同區域進行成像對比存在難度。另外，IVCM檢查是產生的大量缺乏結構特異性的圖像，即使是經驗豐富的醫生對結果的判讀仍存在巨大挑戰。當前已有研究使用機器學習的方法輔助醫生進行診斷，但這些研究的圖像通常來自一個醫療中心，單一的設備設置、圖片采集系統和人口特征可能會影響IVCM圖像的多樣性，因而系統性能也會受到影響。且人工智能技術礙于全球醫療大數據的建立未完善以及人工智能處理圖像的過程“黑匣子”特性，使得人工智能算法在圖像層面分析模式和做出決策的方式變得模棱兩可[51,54-55]。

隨著人工智能技術探究與發展，在醫學領域的逐步落地。相信在不久的將來，隨著共焦顯微鏡成像技術的提高以及大數據平臺的構建、AI算法的優化，活體共聚焦顯微鏡能更精確地輔助醫生提高對各類角膜疾病的診斷，提供遵循疾病過程和指導治療的獨特優勢。