線粒體鐵蛋白和年齡相關性黃斑變性的研究進展

許致玉，董 晶，張 璐

0引言

年齡相關性黃斑變性 (age-related macular degeneration, ARMD)又稱老年性黃斑變性，是一種與年齡相關的致盲性退行性眼底病變。歐盟2015年大約有6700萬人受到任何ARMD的影響，并且由于人口老齡化，這一數字預計到2050年將增加15%[1]。隨著我國人口老齡化社會的到來,發病人數將逐年增加。由于ARMD的發病機制復雜，目前對于ARMD的治療發展并不完善，因此ARMD的治療效果并不能讓廣大患者感到滿意。線粒體鐵蛋白(mitochondrial ferritin，FTMT)是一個組織表達受限蛋白,僅表達于心臟、睪丸、腦和呼吸活動活躍的組織。進一步研究發現,FTMT同樣具有鐵離子平衡和抗氧化功能。目前，已有越來越多的學者開始關注FTMT在ARMD中的發生、發展及作用機制。

1 FTMT

FTMT是一種新近發現的位于線粒體內的鐵儲存蛋白。在體內鐵代謝及調節中，FTMT起著重要作用。它是一種前體，以線粒體為目標，然后加工成一種功能蛋白，其結構類似于細胞質中的鐵蛋白。與胞質性鐵蛋白一樣，FTMT在體內和體外都含有鐵，這與其保守的鐵氧化酶中心一致。與其不同的是，FTMT的成熟功能形式只分布于線粒體內，并且FTMT的分布局限于特定的組織或者器官中；主要分布于睪丸、脊髓神經炎、視網膜、心臟和胸腺等，不存在于肝臟或者脾臟等主要的鐵儲存器官中。FTMT可以將細胞外和胞漿內的鐵離子以三價鐵的形式儲存在線粒體中，由此可以減少由二價鐵離子引起的氧化應激產物，但是FTMT的mRNA序列中，不含鐵調控元件序列，這意味著其表達不受鐵的調控。由于對鐵的獲取作用，體內的氧化應激水平進一步被FTMT所抑制，在退行性神經疾病中起到保護作用[2]。在一些免疫組化中顯示，FTMT表達于視網膜，并且表達量會隨著鐵的水平變化而改變(呈正相關)[3]。

FTMT是一種鐵螯合蛋白，在具有高代謝活性和氧消耗的細胞類型(包括人類視網膜)中表達，提示其在保護線粒體免受鐵依賴性氧化損傷中起作用。此外，在一些ARMD患者中發現了FTMT基因的突變，這可能導致FTMT基因的缺失[4]。然而，FTMT已顯示出保護線粒體免受鐵細胞介導的毒性作用，從而延遲ARMD的進程。

2 ARMD

ARMD是黃斑區的退行性病變。主要表現為視物變形、中心暗點以及對比度下降等，患者多為50歲以上,隨著年齡增長發病率增加。一般表現為雙眼先后發病或同時發病，并且進行性損害視力，嚴重影響老年人的生活質量。有學者研究表明，在全球50歲以上的中國人群中，早期和晚期ARMD的總合并患病率分別為4.9%和0.7%[5]。

ARMD根據臨床表現和病理改變的不同分為兩型：(1)萎縮型ARMD，或稱為非滲出型ARMD,或干性ARMD；(2) 滲出型ARMD，或稱為濕性ARMD。其中最常見的為干性ARMD，占ARMD患者中的80%～90%。臨床上，兩型病變的病程、眼底表現、治療和預后各異。干性ARMD患者一般起病緩慢，患者視力漸進性減退，視網膜外層、色素上皮層、Bruch膜、脈絡膜毛細血管等各層逐步萎縮、變性，眼底可見大小不一的玻璃膜疣，晚期可見到裸露的脈絡膜大血管。濕性ARMD患者臨床表現為突然單眼的視力下降，部分可見典型的新生血管或者黃斑區盤狀瘢痕[6]。目前臨床上公認的用于治療濕性ARMD的方法為抗VEGF治療，通常采用將可結合VEGF的特異性抗體通過球內注射的方式給藥，臨床效果顯著。但是該藥藥物效果難以持續，并且費用昂貴，大大增加了治療的成本，使絕大多數中低收入患者群體難以維系治療。

由于ARMD的發病機制和進展機制復雜，因此很難找到病因，并且難以運用干預手段來治療疾病。它可能與遺傳因素、環境影響、慢性視網膜光損傷、營養不良、代謝紊亂等有關。但是氧化應激和自由基損傷已被確定為ARMD的危險因素。下面將探討FTMT對ARMD的影響。

3 FTMT通過穩定低氧誘導因子-1α影響ARMD

低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是20世紀90年代發現的一種依賴于氧的轉錄因子。HIF最初是在人肝癌細胞培養中發現并表征的，其影響促紅細胞生成素基因的轉錄。后有研究表明，HIF亞型HIF-1在ARMD患者脈絡膜新生血管膜中同樣存在。由于人視網膜色素上皮細胞培養中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的產生受HIF調控，任何對HIF和PAS蛋白結構域抑制功能的干擾都會影響眼睛的氧化應激、炎癥和脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的生成[7]。

CNV的發展是對ARMD患者快速永久性視力喪失的最重要威脅。各種臨床研究表明，隨著年齡的增長，視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)，Bruch膜和絨毛膜的變化會導致氧向神經視網膜中的視桿和視錐的擴散減少。因此，通過刺激RPE細胞中VEGF的過表達導致外部視網膜缺氧被認為是CNV形成的最重要驅動因素之一[8]。一旦擾亂了血管生成刺激劑和抑制劑之間的局部平衡，便可能發生CNV。VEGF是CNV的主要刺激因子，Zhao等[9]研究表明RPE細胞過度表達VEGF可誘導CNV的發生，而抑制RPE細胞中VEGF的表達則抑制新生血管的形成。HIF-1α的轉錄激活可上調RPE細胞和一般RPE細胞中VEGF的表達。因此，它是觸發CNV形成的中心分子[10]。因此，HIF是治療滲出性ARMD的一個有趣的治療靶點。

Wang等[11]發現小鼠RPE中的FTMT和HIF-1α與年齡相關性是有聯系的。他們通過Western blotting和免疫熒光法比較了幼齡和老年小鼠RPE和絡膜中FTMT蛋白的水平?？刂蒲芯窟M行了評估的特異性FTMT抗體。結果顯示，與3mo大的小鼠相比，使用RPE和脈絡膜勻漿的Western印跡顯示20mo大的小鼠的FTMT和HIF-1α蛋白水平顯著升高。免疫組織化學顯示，20mo大小鼠的神經節細胞(ganglion cells，GCS)，外神經叢層(outer plexiform layer，OPL)和內部節段(inner segment，IS)主要被FTMT染色。在20mo時，染色強度增加。特別是，RPE和外部脈絡膜節段被強烈染色。所以，小鼠RPE中FTMT和HIF-1α水平隨著年齡的增長而升高。

與此同時，該實驗還證明FTMT穩定了HIF-1α并上調了VEGF的表達。研究者在人視網膜上皮細胞(ARPE-19細胞)中過表達FTMT 。 Western印跡結果顯示，在正常缺氧條件下，FTMT過表達的ARPE-19細胞中的HIF -1α蛋白水平顯著增加。在低氧條件下(1%O2)HIF-1 α蛋白水平高于未處理的細胞。FTMT過表達顯著增加了VEGF的分泌，而這種增加被HIF-1 α修飾因子所消除，表明FTMT過表達時VEGF的上調是依賴于HIF-1α的[8]。因此，增高的氧化應激水平影響著FTMT在ARMD患者中的表達，并且HIF-1α調節FTMT來控制ARMD的發展。

4 FTMT基因突變影響ARMD

胞質鐵主要完成了鐵在細胞中的儲存，是一條24亞基(重-h和輕-l鏈)的雜合聚蛋白。有學者發現，哺乳動物的功能性鐵蛋白基因有三個，分別是：11號染色體上183個氨基酸編碼的胞質重鏈(h鏈)； 19號染色體上175個氨基酸編碼的胞質輕鏈(l鏈)和5號染色體上的無內含子基因編碼的FTMT，并表達為前體，在轉移到線粒體基質后被加工成成熟蛋白[7]。

在人類中，FTMT在睪丸、大腦和視網膜光感受器內表達， FTMT的表達影響細胞內鐵穩態，使鐵進入線粒體，FTMT通過氧化潛在的有毒亞鐵并且消耗活性氧(reactive oxygen species，ROS)，保護HeLa細胞免受氧化損傷[12]。這些數據表明，FTMT的主要功能是通過調節線粒體不穩定鐵池和ROS的產生，以防止氧化損傷[12]，并提示FTMT在線粒體中對鐵依賴毒性具有保護作用。FTMT功能在以細胞鐵超載和線粒體衰退引起的鐵代謝紊亂為特征的病理中可能特別重要[13]。最近，在一些ARMD患者體內發現FTMT的基因突變，而該突變可造成FTMT功能的缺失[14]。

Stefania等[4]對一組ARMD患者的FTMT基因進行了突變掃描，以評估其可能對ARMD表型的發病機制或調節的研究貢獻。到目前為止，FTMT基因中的一些雜合取代物已經在與細胞或FTMT表達或腦鐵水平改變相關的疾病患者中被發現[15]。他們從一個被發現攜帶一個之前從未報道的FTMT基因突變的老年白人女性的血液中進行FTMT基因的采集及提取，從EDTA抗凝血中提取DNA中通過變性高效液相色譜和自動測序進行分析，短擴增產生的缺失片段經電泳分離后洗脫，通過神經網絡程序對剪接位點進行預測，通過鐵蛋白重組、變性復性實驗以獲得共組裝的24序列堿基，通過免疫學方法將FTMT抗體孵育，進行基因結果的分析。結果顯示，50例意大利ARMD患者的FTMT基因掃描顯示，只有1例ARMD患者的FTMT2基因洗脫譜發生了改變。該突變包括一個14bp的缺失和一個2bp的插入。研究者評估了變異FTMT是否會通過干擾野生型FTMT的組裝而產生主導的負面影響。并進行了變性-再變性實驗，將恒定量的變性野生型FTMT與不同量的變性變體混合并再變性。通過蛋白質帶密度定量分析發現，不斷增加的變異亞基并不影響野生型FTMT的重新折疊特性。因此，該變體的顯性負面效應的缺失使得野生型FTMT的正確組裝成為可能。這些結果表明，突變可能導致FTMT的功能改變，而該功能改變可能是ARMD的病因之一。

因此，可以假設鐵蛋白基因的野生型等位基因的存在可能足以補償功能蛋白的量。然而，在視網膜這個特別暴露于氧化應激的組織中，FTMT的減少可能增強了線粒體對鐵介導的氧化損傷，從長遠來看可能與ARMD病理的發展有關。因此，該患者的FTMT基因突變的發現，不僅為臨床治療提供新的思路，它們還為探索ARMD的發展機制提供了新的線索，并可能成為研究結構-功能關系和闡明相應蛋白中尚不明確的功能的有趣實驗試劑。

5 FTMT保護ARMD免受氧化應激

在ARMD中，鐵可能作為自由基損傷的來源發揮作用。對于許多參與細胞代謝的許多蛋白質和酶來說(包括氧氣運輸、呼吸鏈電子轉移、DNA合成和膜生物發生)，鐵是一種必要的輔助因子。在視網膜中，鐵被脂肪酸去飽和酶所利用，該酶參與膜的生物發生。RPE和神經視網膜脈管系統是參與鐵運輸的獨立血液視網膜屏障。循環鐵轉鐵蛋白復合物結合細胞表面轉鐵蛋白受體(transferrin receptor, TFR)，鐵被吸收到細胞中，然后通過血-視網膜屏障轉運到視網膜[16-17]。在與年齡有關的眼疾研究中，一項大型的多中心，隨機對照的臨床試驗發現，飲食中添加抗氧化劑和鋅可顯著降低進展為晚期ARMD的進程。盡管研究表明ARMD的發病機制可能與氧化應激相關，但是自由基的來源還需進一步研究[18]。

Gao等[19]實驗證明FTMT的水平不會因外源性鐵而升高。但是當轉染增加時，FTMT保留了高比例的鐵，細胞顯示出缺鐵的跡象。所以研究者得出結論：鐵對FTMT的潛在易得性與對胞質鐵蛋白的易得性相同，而對FTMT 水平的控制可能為調節細胞鐵穩態提供了一種強有力的方法。所以FTMT被證明可以顯著調節細胞鐵代謝，進而進一步影響著ARMD的發生與發展。FTMT保護線粒體免受氧化損傷的研究已經在其他疾病中取得了一些成就。FTMT過表達可以保護6-羥多巴胺誘導的多巴胺能損傷，可能在帕金森病中發揮重要的神經保護作用。Shi等[20]發現了FTMT對過氧化氫誘導的神經元細胞損傷的作用，FTMT的過表達顯著保護了神經母細胞瘤免受過氧化氫誘導的凋亡，這是由于FTMT對細胞內ROS的增加和MMP的降低的限制作用，從而保護了細胞免受氧化應激介導的細胞凋亡。

對于FTMT保護線粒體免受氧化應激與ARMD相關的研究中，我們發現FTMT的抗氧化應激作用可能是由于鐵離子的調節以及通過芬頓反應減少超氧自由基的產物所致，從而減少氧化應激的損害。最近，研究了一些FTMT基因被敲除的小鼠，但是，關于視網膜中缺乏FTMT的影響還需進一步研究。

6小結

ARMD是一種復雜的多因素疾病，具有人口、環境和遺傳方面的危險因素;然而，即使近年來進行了大量的研究，其發病機制仍大部分未知。對于FTMT的研究，從分子生物學的角度探究FTMT在RPE細胞的蛋白質功能，闡釋其在ARMD發病和疾病進展中的作用。借此增進對該疾病的病理生理機制的認識，以求更有效的治療ARMD的方法。FTMT作為一種儲存性鐵蛋白，目前的研究主要集中在神經功能退行性疾病中，對于眼科相關研究處于起步階段?，F今以及未來的研究將從根本上回歸疾病的本質，尋求疾病的致病原因，以期從根本上找到治療和干預ARMD發生的靶點。盡管目前對于ARMD與FTMT關系的研究較少，但是它已經展示出了廣闊的應用前景。我們希望未來能夠探索出更多的發展機制，為預防甚至降低ARMD的發生率做出更大的貢獻。