動物血清的成分及在細胞培養中的作用

石嘉琛，王家敏，喬自林 *

（1.西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學工程學院，甘肅 蘭州 730030）

20世紀50年代，研究人員開始將血清作為一種細胞培養基添加物使用，獲得了良好的培養效果。添加血清的培養基的效果與未添加血清的培養基相比，細胞活率更高，生長密度更大，持續培養時間更長。一些要求較高的細胞需要在培養體系加入自體血清，如大鼠關節軟骨細胞[1]、豬耳緣成纖維細胞[2]等。新生牛血清或胎牛血清是細胞培養中常用的生長補充劑，主要是因為它具有高水平的生長刺激因子和低水平的生長因子。使用牛血清作為培養基添加劑在建立原代細胞培養、維持器官/組織外植體和干細胞繁殖的情況下仍然是必要的，因為血清具有促進分化的功能，還具有運輸攜帶激素（如轉運蛋白）、礦物質和微量元素（如轉鐵蛋白）和脂質的蛋白質的功能，且含有貼附和擴散因子，在維持pH值或直接抑制蛋白酶作用方面也有一定效果，使用血清就不需要為每個細胞系和菌種優化培養基，這可節省大量人力物力，加快研究進程[3]。

1 血清所含成分對細胞培養的影響

血清組成成分十分復雜，包含蛋白質，多肽，激素等一些細胞生長的有益因子，如白蛋白可作為載體蛋白攜帶小分子物質，維持細胞生長，還具有緩沖pH的作用。可能污染病毒、支原體等外源微生物的新生牛血清可通過滅能處理進行滅活，但同時可能使血清內有利于細胞培養的生物活性物質變性降解，從而影響細胞的培養[4]。一項關于胎牛血清組成的研究表明，隨著時間的增加，幾種細胞外基質和結構蛋白的數量以及營養相關蛋白、細胞擴散蛋白的數量都會發生變化，這種差異性不僅迫使大多數實驗室進行他們自己的胎牛血清和新生牛血清篩選，并且在此之后使用“預先選擇”的批次，它也常常使不同研究者的數據處理變得困難[5]。

2 血清濃度對細胞培養的影響

在一定范圍內，提高細胞培養基含有的血清含量，可促進細胞分化速度,但血清濃度過高會導致細胞生長狀態異常[6]。一般來講，在培養基中添加5%～20%的血清可滿足絕大多數細胞生長所需的營養物質。采用T75方瓶和轉瓶培養PK15細胞時只需要在培養基中添加5%的血清即可生長狀態良好，經過72 h的培養后，細胞增長倍數均為10倍以上[7]。

細胞在含有一定培養基血清濃度的細胞培養基中生長時，血清所含的生長因子可維持細胞的快速生長，有助于阻止細胞的機械損傷[8]。一項培養基中血清添加量對于成纖維細胞的影響表明，10%血清濃度條件下成纖維細胞形態穩定，增殖速率較高，但40%血清濃度對成纖維細胞有損害作用，出現了細胞數量下降的現象[9]，肝細胞原代培養中血清濃度為20%時會對肝細胞造成一定傷害[10]。血清是細胞生物制品生產中的主要成本，幼小倉鼠腎細胞（BHK21細胞）經過一段時間的馴化可以逐步適應低血清培養條件，但其營養物質代謝速率、乳酸和氨的積累速度降低[11]。添加15%FBS的培養基可取得較好的牛原代肌衛星細胞和前體脂肪細胞共培養效果[12]。轉瓶培養是疫苗生產中常用的貼壁細胞培養方式，豬乙型腦炎病毒可在Vero細胞中增殖，維持液的血清濃度不僅影響細胞生長，對病毒效價也有一定影響，血清濃度在1%～4%范圍內時，病毒毒價隨濃度升高而升高，維持液血清濃度超過 4%后，毒液的效價下降[13]。

3 血清種類對培養效果的影響

血清根據來源動物品種不同可分為人血清、馬血清和牛血清等。牛血清來源較豐富，目前廣泛應用于細胞培養。牛血清制品可分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清，在這三種血清制品中，胎牛血清品質最高，胎牛因未接觸到外界，血清中的細胞毒害成分最少，但其價格在牛血清中是最為昂貴的[15]。

胎牛血清（Fetal Bovine Serum，簡稱FBS）是經心臟采集230～240日齡的胎牛全血，分離血清，經濾過除菌制成，是疫苗生產的重要原輔料之一[18]。胎牛血清是細胞培養中效果最好的天然培養基，可提供細胞貼壁、鋪展在塑料培養基質上所需因子，還能發揮酸堿緩沖液作用[17]。新生牛血清指采集出生時間小于24 h的健康牛犢的血清，它是細胞培養中用量最大的天然培養基，含有血小板促生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子等，在可獲得較好的細胞生長增殖效果[19]。

目前市場上血清種類繁多，李自良等[15]對國產胎牛血清、進口胎牛血清、國產新生牛血清對MDCK細胞促生長效果做了相關研究，結果表明，國產新生牛血清可連續傳代MDCK細胞，細胞生長良好，排列緊密，不同代次MDCK細胞長成致密單層時細胞形態基本一致，但新生牛血清的有效集落數低于胎牛血清，這可能與二者所含的激素和其他活性物質等組分與比例不同有關。王梅珂等對于國產血清和進口血清對于Vero細胞形態、細胞匯合度的影響進行了研究，發現國產的一批血清細胞收獲量值大于3.00×108個/ml，且細胞相對增長率大于90%，與進口血清促細胞生長效果相近，可替代進口血清[16]。

4 細胞培養使用血清存在的不足

牛血清來源廣，即便是同一來源，同一批次的血清質量也存在很大差異，具有因化學、蛋白質方面差異和內分泌參數的血清變異性，這提示我們在解釋使用血清補充劑可能具體定量的實驗結果產生干擾或調節，血清作為細胞生長和維持的重要物質，在細胞培養中發揮重要作用的同時，也帶有許多至今無法解決的問題和弊端[20]，如血清中成分復雜，不能準確加以區分血清批次間差異很大，且血清的保存期短，給批次生產的標準化和連續化帶來限制。牛血清在使用時需要低溫儲存，然后解凍使用，血清中的脂蛋白產生沉淀，營養價值流失，從而影響細胞的營養物質供應，造成細胞生長緩慢。

生物技術的發展、生物醫學的進步都離不開細胞培養，很多牛血清供應商為小型企業，質檢存在很多局限性，且生產環境是否合格無菌，設備的科技程度也因成本的限制而存在問題。2000年10月1日，《中國生物制品主要原輔材料質控標準》開始實施，牛血清質量雖有提升，但影響牛血清質量的主要因素是大腸桿菌或噬菌體的污染，其次是細胞增殖檢查及細菌內毒素[21]。此外，血清在培養基中的存在使產品的分離純化變得更加復雜，牛血清作為細胞培養常用的天然培養基，其成本較高，且易被外界的雜菌污染[22]。牛血清蛋白可能內化在干細胞上，刺激產生免疫原性，因此，可能會產生許多潛在的問題，如病毒和朊病毒的傳播，或由于牛蛋白附著在細胞上而引起的免疫反應，這些細胞在移植后充當抗原基質。

5 結語

血清作為細胞培養中大量使用的培養基添加物，具有其他物質無法比擬的優勢，使用血清最大的缺點是其未經測試的生物安全性和補充基本培養基的額外成本，針對這些問題，需要制定一個全面，科學的血清生產行業規范，加速產業升級，使用血清替代品，主要是使用化學確定的培養基，可減輕風險，但目前血清仍然是建立和維持原代細胞系和連續細胞系的過程中使用最廣泛的添加物，對其化學組分的不明確也制約著血清的生產和質量把控，一旦成分明確，相信血清將會成為生命科學研究中的一把利器。