視網膜色素變性的實驗研究進展

蔣鵬飛，彭 俊，歐 晨，姚 震，田 野，王 英，彭清華,

0引言

視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種遺傳性視網膜病，遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及性連鎖隱性遺傳等，其特征是雙眼發病，慢性進行性視力損害并伴有眼底色素變化[1]。影響全世界約250萬人，我國人群發病率約為1/4000，男女比例約3∶2[2]。其特征在于視桿細胞和視錐細胞的逐漸喪失，由此導致嚴重的視覺功能障礙和雙眼最終失明。除了來自約70個基因的超過3 000個基因突變點之外，已經報道了RP與其他類型的視網膜營養不良的廣泛遺傳重疊[3]。這種遺傳病理生理學的多樣性使得治療極具挑戰性。雖然已經使用各種藥理學試劑(神經營養因子、抗氧化劑和抗凋亡劑)進行了嘗試治療，但大多數并未針對RP的根本原因，并且其臨床療效尚未得到明確證實[4]。目前正在進行或已完成的臨床試驗中RP的治療包括基因治療、細胞治療和視網膜假體等[5]。眼科學者對視網膜色素變性進行了大量實驗研究，取得了一定進展，本文對近年來視網膜色素變性的實驗研究進行了綜述，并對其未來研究方向進行了展望。

1藥物治療

1.1中藥RP的特征在于視桿細胞的死亡，隨后是視錐細胞的死亡，逐漸導致部分或完全失明。所有能延緩視網膜感光細胞死亡的藥物均能在一定程度上治療RP。對4、12、24周齡的視網膜色素變性小鼠灌胃中藥復方夜明顆粒(由熟地10g，枸杞子10g，黃芪15g，丹參15g，當歸10g，制首烏10g，山萸肉10g，靈芝6g，白芍10g，枳殼6g等組成)，給藥28d后發現不同周齡的視網膜色素變性小鼠視網膜光感受器細胞層數均多于空白組，組間差異有統計學意義(P<0.05)，說明夜明顆粒能延緩視網膜感光細胞死亡[6]。視網膜色素變性皇家外科學院(Royal College Surgeons，RCS)大鼠是一種較成熟的視網膜退化的動物模型，與人類RP有許多相似之處[7]。對RCS大鼠灌胃中藥復方益氣明目丸(由黨參10g，黃芪15g，白術10g，菟絲子15g，山藥10g，茯苓10g，黃精15g，北柴胡10g，葛根10g，丹參15g，當歸10g等組成)懸濁溶液，30d后，HE染色觀察RCS大鼠視網膜組織結構，免疫組織化學染色法檢測各組視網膜組織中Bax、Caspase-3表達，Western Blot法測定各組視網膜組織中Bax、Caspase-3蛋白相對表達水平。結果發現益氣明目丸組大鼠視網膜厚度明顯較模型組大鼠視網膜增厚，光感受器細胞核數目較模型組多，且益氣明目丸組大鼠視網膜組織結構較模型組清晰；益氣明目丸組視網膜凋亡因子Bax、Caspase-3平均光密度值均較模型組減少(P<0.01)[8-9]，說明益氣明目丸可有效緩解視網膜感光細胞的凋亡，從而對RP起到治療作用。

夜明顆粒與益氣明目丸均含有中藥丹參，宋厚盼等[10]基于網絡藥理學和生物信息學方法分析了丹參治療RP的分子機制，篩選丹參的入血活性成分和作用靶點，得到與丹參相關的化學成分202個，篩得活性成分65個，其中入血活性成分13個，包括隱丹參酮、木犀草素、丹參酮ⅡA等；得到這些成分可能作用的靶點117個；得到85個丹參影響RP病理過程的特征性基因，這些基因主要涉及轉錄調控、凋亡信號通路調控、DNA核內復制調節等生物學過程[10-11]。劉家琪等[12]從實驗研究方面證實了中藥枸杞子-丹參對RCS大鼠視網膜組織結構有改善作用，還可升高αB多肽(alpha B-crystalline，CRYAB)的表達，而CRYAB能抑制凋亡下游基因Caspase-3的激活。

以補腎益精方藥液灌胃RCS大鼠，分別于給藥7、28d時以TUNEL法檢測視網膜感光細胞凋亡情況，與蒸餾水組相比，補腎益精方組視網膜感光細胞凋亡均有所減少(P<0.05)，實時熒光定量PCR顯示給藥7、28d時補腎益精方組視網膜睫狀神經營養因子表達均較蒸餾水組增加(P<0.05)[13]。補腎益精方抑制RCS大鼠感光細胞凋亡的作用可能與神經營養因子的增加有關。

1.2抗氧化劑視網膜感光細胞是除了腦細胞以外氧耗量最多的細胞，隨著RP的進展，視桿細胞死亡，聚集在視網膜的氧無法被消耗，引起視網膜細胞氧化損傷[14]。Sulforaphane(SFN)已被證實是治療許多疾病的有效抗氧化劑，視網膜色素變性小鼠和野生型(wild type，WT)小鼠分別用SFN和生理鹽水處理，檢測其視網膜電圖及視網膜細胞凋亡情況，與生理鹽水組相比，SFN治療組視網膜電圖a波和b波振幅明顯增高，視網膜細胞凋亡基因下調，光感受器細胞死亡率降低[15]。表明抗氧化劑SFN對視網膜色素變性有一定的治療效果。

1.3抗凋亡劑補體激活被認為可抑制視網膜病變中的神經變性[16]，多種補體成分在人與rd10小鼠中光感受器變性時顯著上調，C3表達的增加激活了視網膜小膠質細胞，小膠質細胞可清除凋亡光感受器，如果C3缺乏，會減少凋亡光感受器的小膠質細胞吞噬作用并增加對光感受器的神經膠質細胞神經毒性。CR3是C3激活產物iC3b的小膠質細胞表達的受體，增加其表達可有效減少小膠質細胞神經毒性，增加凋亡感光細胞清除率[17]。

1.4神經營養因子3,4-二羥基苯甲酸甲酯(methyl 3,4-dihydroxybenzoate，MDHB)是一種在體外發揮神經保護作用的小分子，有神經營養作用和減少反應性神經膠質增生的能力，可用于治療視網膜的退行性疾病，而RP存在視網膜感光細胞的退化，在機制上MDHB可以治療RP。視網膜色素變性rd10小鼠從出生后第12d直到第26d，每天在rd10小鼠腹膜內注射MDHB或等體積的載體。與未處理的動物相比，MDHB處理顯著促進視網膜光感受器存活并保持錐體形態；在MDHB處理的rd10小鼠中，視覺行為和ERG反應也大大增強；MDHB還可抑制rd10小鼠視網膜中小膠質細胞激活和Müller細胞膠質增生；使用拮抗劑ANA-12可以阻斷MDHB對光感受器存活和結構的保護作用，證明MDHB確實可用于RP的治療[18]。

殷曉貝等[19]以不同劑量腦源性神經營養因子玻璃體腔注射治療RP小鼠，發現劑量越高，RP小鼠視網膜抗凋亡蛋白表達越高。證明神經營養因子對RP有治療作用。在出生10d的RP小鼠玻璃體腔內注射睫狀神經營養因子，在14、18、22、30d的視網膜電圖a波和b波波幅均高于空白對照組，說明在玻璃體腔內注射睫狀神經營養因子能有效延緩RP小鼠視網膜感光細胞的凋亡[20]。

2細胞移植

細胞移植是將細胞引入患者眼內產生健康細胞，以期能夠替代無功能的細胞并與剩余的視網膜細胞連接。多能干細胞(pluripotent stem cells，PSCs)，包括胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，在分子上與功能上都具備與體內的視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細胞相同的分化潛能，相較于PSCs，人類胚胎干細胞(human embroynic stem cells，hESCs)來源的RPE細胞移植更能有效挽救感光細胞[21]。

視網膜色素變性GTP酶調節劑(retinitis pigmentosa GTPase regulator，RPGR)的突變可導致X連鎖RP，RPGR定位于連接纖毛的感光器，未突變的RPGR與肌動蛋白的凝溶膠蛋白相互作用并將其激活，凝溶膠蛋白可調節連接纖毛中的肌動蛋白分解，從而促進視紫紅質(Rhodopsin，RHo)轉運到光感受器外部區域。RPGR的突變擾亂了這種RPGR-凝溶膠蛋白相互作用，損害了凝溶膠蛋白的活化。RPGR和凝溶膠蛋白敲除小鼠均顯示光感受器中肌動蛋白聚合和Rho錯誤定位的異常。使用鼠和人誘導的PSCs模型可恢復光感受器中肌動蛋白的聚合，最終阻止RP的進展[22]。

3基因治療

基因療法是一種利用病毒或非病毒載體糾正遺傳缺陷的治療策略，有可能通過替換或沉默致病基因來實現最終治療，隱性遺傳或X連鎖突變的RP患者對基因治療更敏感。對已確定致病基因的RP來講，基因治療是目前最有潛力的治療方式。RP基因治療的相關研究日益增多，涉及多種RP相關基因。其中，RPE65是恢復視網膜色素上皮中感光細胞功能所必需視覺色素必需酶，目前已鑒定出60多種不同的RPE65基因突變。在遺傳性視網膜疾病基因治療的許多臨床試驗中，voretigene neparvovec(AAV2-hRPE65v2，Luxturna)的3期臨床試驗顯示對RPE65介導的遺傳性視網膜疾病有顯著療效，包括Leber先天性黑矇和RP。Luxturna即將被批準作為第一個眼部基因治療生物制品[23]。

導致RP的基因突變點較多，近來發現p75NTR基因突變可導致RP，在rd10小鼠中，也發現了p75NTR基因，與WT小鼠相比，在感光細胞死亡峰值之前的早期退化階段，rd10小鼠視網膜中p75NTR的下游細胞因子proNGF水平增加；在光感受器細胞喪失期間，ProNGF也保持升高。對rd10小鼠單次玻璃體內或結膜下注射p75NTR的拮抗劑THX-B，對視網膜感光細胞有神經保護作用[24]。

在Rho中超過150種不同的突變均可引起RP，Rho突變是常染色體顯性遺傳RP的最常見原因，常染色體隱性遺傳RP多與Rho功能喪失有關。以生長相關蛋白43慢病毒載體轉染脂肪間充質干細胞可提高視網膜外核層厚度，提高Rho蛋白表達，對視網膜色素變性具有較好的作用[25]。P23H是Rho基因中最常見的突變位點，CRISPR/Cas9組分可在視網膜P23H基因位點中呈現高速率切割，在WT型小鼠中Rho等位基因中則不切割，這種特異性破壞P23H突變體同時又保留WT功能性等位基因的方式有效地減緩了感光細胞變性。同時，該方法在P23H基因突變的人感光細胞中也成功翻譯[26-27]。雖然約45%的突變P23H等位基因在DNA水平上被編輯，但相對RNA表達在P23H突變小鼠中更加靈敏，WT小鼠Rho突變相對RNA表達是P23H突變小鼠Rho相對RNA表達的約2.8倍。利用SpCas9變體和截短RNA間隔介導的等位基因特異性敲除方法，可以實現P23H突變小鼠中相對RNA突變的有效區分，對視網膜感光細胞變性的延遲更加顯著[28]。以基因消融聯合基因替換治療的方式破壞內源性Rho基因的表達，治療后視網膜外核層厚度比單純AAV注射高17%～36%[29]，基因消融聯合基因替換可以治療由不同Rho突變引起的RP，而不單單針對某一基因突變位點，因此該種治療方式可用于治療眼科和其他領域中的多種遺傳性疾病。

分離和培養人臍帶來源間充質干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs)，以色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor，PEDF)重組慢病毒轉染hUCMSCs，攜帶PEDF基因的重組慢病毒載體，能高效感染hUCMSCs，感染后的hUCMSCs進行傳代培養，慢病毒可延長目的基因在細胞內的表達。將PEDF-hUCMSCs注射到RCS大鼠視網膜下，注射8wk后視網膜外核層厚度高于注射hUCMSCs組[30]，說明基因治療較單純細胞移植有更好的治療作用。

許多X連鎖遺傳RP動物模型中成功地建立了RPGR的基因替換腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)載體，RPGR富含嘌呤的區域因含有高度重復的核苷酸序列，其固有序列不穩定，常導致病毒載體克隆過程中出現重組錯誤，給實驗帶來較大難度。有研究指出[31]，病毒載體中重組錯誤出現的主要原因是RPGR蛋白中的谷氨酰化模式與WT變體無法區分。以針對人X連鎖遺傳RP的AAV8載體是一種優化的基因替代療法，該載體可一致地產生全長正確的RPGR蛋白，通過AAV8載體遞送并由Rho激酶啟動子驅動時，密碼子優化的RPGR在兩種RP動物模型均表現出較好的療效，并且有良好的安全性，為臨床試驗提供了治療基礎。在GRK1啟動子控制下的RPGR突變體狗中使用密碼子優化的人RPGR(hRPGRstb)和RPGR(hRPGRco)兩種基因，可抑制狗視網膜感光細胞的退化，從而保持視力[32]。

磷酸二酯酶6-α(phosphodiesterase 6-alpha，PDE6A)基因的突變被廣泛認為是人視網膜色素變性的原因，AAV-8的PDE6A在PDE6A突變狗視網膜中有快速的轉基因表達，對10只PDE6A突變狗進行視網膜下注射，與未治療的眼睛相比，治療眼視網膜感光細胞層厚度得以保留，感光細胞也得以存活[33]，但是也存在一些副作用，如視網膜脫離等。多項研究[34-35]均將人類RP的突變基因在動物RP中進行了基因增強，以往研究的基因突變動物多為小鼠和大鼠，現在越來越多的基因突變動物為大型動物，如犬類等，結果表明基因增強療法可提高視網膜感光細胞的存活率，降低視網膜感光細胞死亡速度，從而挽救視力。

4展望

眼科學者對RP進行了大量的實驗研究，開發出多種RP治療方法，本文對其進行了一些總結。其中藥物治療與其它治療方式相比，無侵入性，且方便價廉，如能對藥物尤其是中藥的作用機制進行更加深入的研究，將有利于研發出效高的新型藥物。自體干細胞植入被認為是治療RP的一種有效方法，但也有報道稱自體干細胞移植會引起視網膜前膜及黃斑皺褶[36]，因此干細胞移植的安全性仍需進一步實驗研究論證。基因治療雖然存在一定的局限性，如靶基因過于單一，而導致RP的突變基因較多；給藥方式有侵入性，會有患者眼睛帶來損傷；臨床療效不確切等。但隨著基因編輯技術和新型基因遞送載體的發展，基因治療在未來會成為RP和其他遺傳性視網膜疾病最有希望的治療方式之一，但將實驗研究成果運用于臨床仍有很長的道路要走。