RP-HPLC法測定面包中丙酸

鄒沫君

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

丙酸又稱初油酸，是無色、有腐蝕性易燃的液體，毒性比甲酸小，對眼睛、皮膚、黏膜有刺激作用，與乙酸一樣有殺菌性，能抑制細菌的生長，主要用作食品防腐劑和防霉劑[1]。至今廣泛用于食品防腐劑的三大品種為苯甲酸及其鈉鹽，山梨酸及其鉀鹽，丙酸及其鹽鈉鹽、鈣鹽。苯甲酸及其鈉鹽是使用時間最長且應用最廣泛的食品防腐劑，現今隨著人們對其毒性有了一定的認識，不少國家已明令限值或減少使用，而逐漸以山梨酸及其鉀鹽、丙酸及其鈉鹽、鈣鹽代替[2]。丙酸的防真菌和霉菌效果在pH 6.0以下時優于苯甲酸，價格低于山梨酸，是理想的食品防腐劑之一，因而作為食品防腐劑在我國具有巨大的潛在市場[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

DGU-20A 5R高效液相色譜儀（日本島津公司）；FA124電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；TG-16醫用離心機（四川蜀科儀器有限公司）；PHSJ-4A pH計（上海盛磁儀器有限公司）；JJ-2組織搗碎勻漿儀（江蘇金壇市環宇科學儀器廠）；KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DB206電熱鼓風恒溫干燥箱（成都電烘廠）。

1.2 材料與試劑

20批試樣（市售，預包裝食品，每批試樣均來自不同的生產廠家）；丙酸標準品（Lot：123854，99.9%，Dr. Ehrenstrofer GmbH）；磷酸、磷酸氫二銨（分析純，北京百靈威科技有限公司）；水為超純水（電阻率=18.2 MΩ·cm）。

2 方法與結果

2.1 色譜分離系統的確定

2.1.1 標樣的制備

精確稱取25.0 mg丙酸標準品于25 mL容量瓶中，加水至刻度，于4 ℃冰箱中保存，有效期為3個月。

2.1.2 樣品前處理

準確稱取5 g（精確到0.01 g）經組織搗碎機搗碎、35 ℃風干2 h的面包試樣至100 mL燒杯中，加20 mL水，加入0.5 mL 1 mol/L磷酸溶液，混勻，超聲波浸提10 min后，用1 mol/L磷酸溶液調pH至3，轉移試樣至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，將試樣全部轉移至50 mL具塞塑料離心管中，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，經0.45 μm微孔濾膜過濾后，待液相色譜測定。同時做試樣空白試驗。

2.1.3 色譜條件和系統適應性試驗

采用Sepax GP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動相為1.5 g/L磷酸氫二銨溶液，波長為215 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL。

取2.1.1項下對照品溶液，在2.1.3項色譜條件下進行分析。丙酸拖尾因子為0.97，理論塔板數（USP）為23 060。

2.1.4 方法專屬性試驗

丙酸標準溶液、陰性試樣溶液以及陰性加標試樣溶液色譜圖見圖1～圖3。結果表明，該方法專屬性好，選擇性高。

圖1 丙酸標準色譜圖

圖2 陰性試樣色譜圖

圖3 陰性加標試樣色譜圖

2.2 分析方法驗證

2.2.1 線性關系、檢出限和定量限考察

分別精密吸取0.0，0.50，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 μL 2.1.1項下對照品溶液，注入液相色譜儀，在2.1.3項條件下測定，得到峰面積與質量濃度的線性關系，擬合回歸方程式，確定相關系數、最低檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），結果見表1。結果表明，丙酸在0～0.535 3 mg·mL-1質量濃度范圍內線性關系良好，完全能夠滿足面包中其含量的測定。

表1 回歸方程、相關系數、最低檢出限、定量限

2.2.2 精密度考察

取2.2.1項下丙酸線性第4點對照品溶液，按2.1.3項下色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖。以峰面積計算，其RSD為0.58%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.3 方法重復性考察

取編號為A的面包試樣，按2.1.2項下方法制備6份供試品溶液進行色譜分析，計算殘留量。丙酸殘留量RSD值為0.69%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 溶液穩定性考察

取制備好的編號為A的面包供試品溶液，按2.1.3項下儀器條件分別于0，4，8，12，16，20和24 h進樣測定，記錄色譜峰面積，計算丙酸RSD，為0.74%（n=7），表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.5 耐用性考察

取2.2.1項下線性第4點對照品溶液，分別采用不同柱溫（24，25和26 ℃）、不同流速（0.9，1.0和1.1 mL·min-1）進行測定，研究儀器色譜行為的變化。以峰面積計，不同柱溫條件下丙酸RSD為0.81%（n=3）；不同流速條件下丙酸RSD為0.72%（n=3）。表明在實際應用過程中色譜條件有微小變化時，面包中丙酸殘留量測定條件較寬，測定結果不受影響，系統具有較好的耐用性。

2.2.6 回收率考察

表2 回收率試驗結果

精密稱取已測定含量的試樣（編號：A），平行9份，置于100 mL燒杯中，加入適量丙酸對照品儲備液，后按2.1.2，2.1.3項下條件操作，結果見表2。丙酸的平均回收率為99.96%，RSD為0.59%，表明該法具有良好的回收率，準確度符合要求。

3 討論

3.1 檢測波長和流動相的選擇

試驗為了保證丙酸具有適宜的精密度和靈敏度，且減少干擾，采用二極管陣列檢測器對樣品進行全波長掃描，根據對丙酸的紫外光譜圖進行分析，重點考察了195，215和235 nm處的特征吸收圖譜。在215 nm處，丙酸有最佳吸收。比較流動相1.5 g/L磷酸氫二銨溶液（pH 2.5，3.0和3.5）[4-5]，對色譜峰的影響。結果采用1.5 g/L磷酸氫二銨溶液（pH 3.0）等度洗脫，基線平穩，丙酸峰形得到很好的提高。

3.2 提取方式的選擇

比較不同pH磷酸溶液（pH 2.5，3.0和3.5）[6-8]對丙酸提取能力的影響，發現經pH 3.0磷酸溶液超聲浸提10 min，可將樣品提取完全，系統的耐用性好。

3.3 樣品含量測定

取20批不同廠家的面包試樣，各3份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，在2.1.3項色譜條件下測定，采用外標法以峰面積計算含量，結果見表3。

表3 試樣含量測定結果（n=3）

測定了20個不同生產廠家的試樣，丙酸的含量為0.270 2～1.277 9 g·kg-1，測定結果均符合GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[9]。通過比較丙酸含量測定結果，發現不同廠家間存在明顯差異，其原因可能與原輔料的選取和生產工藝的控制有關。因此，食品生產者應嚴把原輔料進廠關，全面規范并提高生產工藝關鍵控制點及質量標準，杜絕過量添加現象，確保食品的安全、健康，從而能夠更好地維護消費者舌尖上的安全。

4 結論

試驗采用簡單一元流動相等度洗脫提高分離效能，試樣中的丙酸鹽通過酸化轉化為丙酸，經超聲波水浴收集后調pH，反相液相色譜分離，外標法定量，建立了測定面包中丙酸的質量控制分析方法，并對市面上20個不同廠家面包中丙酸含量進行了比較，更好地控制面包的內在質量，保證其安全、優質。