玉桂片對(duì)黃褐斑模型小鼠皮膚形態(tài)及酪氨酸酶的作用研究★

易騰達(dá)，萬(wàn)春平，楊登科，葉 飛※

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021；3.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011）

黃褐斑屬于中醫(yī)“肝斑”“黧黑斑”“蝴蝶斑”范疇，是一種發(fā)生在顏面部的呈蝴蝶狀的色素沉著性疾病，局部常為褐色，多見(jiàn)于成年女性[1]，病因及病理機(jī)制尚不十分清楚。中醫(yī)認(rèn)為，與肝、脾、腎三臟關(guān)系非常密切；現(xiàn)代研究普遍認(rèn)為[2、3]，黃褐斑主要是由于黑色素在皮膚內(nèi)增多所致，而黑素細(xì)胞增多和黑色素生成增多是導(dǎo)致黑色素增多的兩個(gè)十分重要的因素。

研究表明[4、5]，酪氨酸酶在皮膚黑色素合成過(guò)程中起著重要作用，它直接影響黑色素合成的速率，并且是黑素細(xì)胞分化以及成熟的特征性標(biāo)志。西藥治療本病的手段及藥物比較有限，其主要目的是減輕面部褐斑的顏色，但大多數(shù)外用西藥存在一定的副作用及不良反應(yīng)，且不適宜長(zhǎng)期使用[6-8]。然中醫(yī)藥治療本病手段較豐富，治療后效果顯著且無(wú)明顯副作用。此外，亦有研究表明[9]，臨床上具有美白功效的中藥大多通過(guò)抑制酪氨酸酶活性而發(fā)揮作用。玉桂片為云南省已故名中醫(yī)皮膚病專家葉之龍的獨(dú)創(chuàng)良方，該方緊密契合黃褐斑的臨床特點(diǎn)及綜合考慮云南特殊地理氣候因素，組方科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，并且在昆明市中醫(yī)醫(yī)院皮膚科應(yīng)用20 余載，療效顯著。然而玉桂片治療黃褐斑的療效機(jī)制尚不十分明確，故本研究以此為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討其治療機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48 只清潔級(jí)健康雌性小鼠（昆明種），體重20g 左右（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。由實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，隨機(jī)分組，在自然條件同等情況下，常規(guī)飼食飲水。室溫：20℃～25℃，濕度：20%～30%，維持自然光照，自然攝食、飲水，飼料為全價(jià)顆粒飼養(yǎng)（Ca：0.5%）飼養(yǎng)10 天待適應(yīng)環(huán)境后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 玉桂片（由中藥飲片玉竹、肉桂組成，我院藥物制劑科制備），維C 注射液（河南天方藥業(yè)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 酪氨酸酶活性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶，50T/48S）、BCA 蛋白測(cè)定試驗(yàn)盒（北京索萊寶）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外線光療儀（深圳冠宏雅，320nm）、電動(dòng)玻璃習(xí)漿機(jī)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀，1 600r/min）、系統(tǒng)生物顯微鏡，病理圖像分析系統(tǒng)、酶標(biāo)儀、恒溫孵育箱（上海合恒）、分光光度計(jì)（雙鹿，UL-1000）等。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 黃褐斑小鼠模型的分組、誘導(dǎo)和給藥 48 只昆明種雌性小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、維C 預(yù)防組、維C 治療組、玉桂片預(yù)防組和玉桂片治療組。模型誘導(dǎo)采用中波紫外線照射小鼠以復(fù)制黃褐斑實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀０捶纸M編號(hào)，將小鼠分籠飼養(yǎng)。以剃毛器剃去小鼠背部皮膚短毛，然后將脫毛膏涂于該處，（1 ～2）min 后用干燥布巾擦去，再以濕布擦凈。在造模過(guò)程中發(fā)現(xiàn)小鼠背部短毛長(zhǎng)出者，立刻以剃毛器剃盡。并在24h 后進(jìn)行紫外線燈照射。采用光譜值為320nmUVB 的紫外燈燈管照射，燈管距小鼠背部距離為20cm，持續(xù)照射28 天，60min/d。維C 預(yù)防組在造模的同時(shí)，即進(jìn)行灌胃給藥C 注射液。維C 治療組在造模28 天后，再灌胃給予維C 注射液28 天。玉桂片預(yù)防組在造模同時(shí)，即灌胃給予玉桂片。玉桂片治療組在造模28 天后，再灌胃給予玉桂片。28 天后，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水。

1.5.2 藥物劑型、給藥方法和劑量 劑型：維C 注射液：2ml/支；玉桂片：由中藥飲片玉竹、肉桂組成，片劑由我院藥物制劑科制備；給藥方法：以上各組均以灌胃給藥；劑量：根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)換算[10]，玉桂片劑量為0.2ml/只，以純水將玉桂片劑溶水灌胃，3 次/d；維C 組劑量為0.2ml/只，3 次/d。以上兩組給藥皆連續(xù)28 天。

1.6 取材及觀測(cè)指標(biāo)

1.6.1 標(biāo)本采集 取材之前，除去實(shí)驗(yàn)期間死亡（因灌胃致死或自然死亡）的小鼠。于取材之前再行一次脫毛，于小鼠眼眶進(jìn)行取血，并于最后一次灌藥60min 之后將所有小鼠用頸椎脫臼法處死，立即取其脫毛后的背部正中皮膚組織標(biāo)本（約 1.0cm×1.0cm）。

1.6.2 病理形態(tài)學(xué)觀察 取小鼠背部正中的皮膚組織并制作病理切片，采用HE 染色于顯微鏡下觀察小鼠皮膚形態(tài)的病理變化，以了解玉桂片的干預(yù)效應(yīng)。

1.6.3 酪氨酸酶的含量測(cè)定 將血液離心15min，取其上清液，按酪氨酸酶試劑盒說(shuō)明嚴(yán)格操作，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 玉桂片對(duì)小鼠皮膚染色的病理形態(tài)的影響 HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠皮膚的表皮層、真皮層結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯炎癥現(xiàn)象。模型對(duì)照組小鼠表皮的上皮細(xì)胞的增生明顯，層數(shù)增加時(shí)，層的數(shù)目增加，出現(xiàn)疣狀增生、乳頭瘤樣增生，局部炎細(xì)胞增多，毛和皮脂腺增生明顯。維C 預(yù)防組皮膚的表層有大量的血液，表皮層缺失，可見(jiàn)部分真皮層、皮下組織。維C 治療組上皮膚的表皮層較薄、真皮層內(nèi)可見(jiàn)汗腺和毛囊分布、皮下組織無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。鏡下放大可見(jiàn)皮膚的表皮層較薄，有些區(qū)域由一層細(xì)胞組成，有些區(qū)域未見(jiàn)細(xì)胞層，真皮層的汗腺和毛囊分布，無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。玉桂片預(yù)防組皮膚的表層暗紅色物質(zhì)為血液和壞死組織，表皮層較薄，真皮層可見(jiàn)少量的毛囊和汗腺。鏡下放大可見(jiàn)皮膚的皮下組織發(fā)生明顯瘀血，真皮層和皮下組織有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為中性粒細(xì)胞。玉桂片治療組皮膚的表皮層較薄、真皮層內(nèi)可見(jiàn)大量的汗腺和少量毛囊分布、皮下組織無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。鏡下放大可見(jiàn)部分皮膚的表層無(wú)角質(zhì)層，表皮層較薄，僅由（1 ～2）層細(xì)胞組成，真皮層內(nèi)可見(jiàn)大量的汗腺和少量的毛囊，無(wú)明顯炎癥反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 玉桂片對(duì)小鼠皮膚染色的病理形態(tài)的影響

2.2 各組小鼠血中酪氨酸酶含量 酪氨酸酶檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠酪氨酸酶含量顯著增加，差異有顯著意義（P ＜0.05）。與模型組比較，玉桂片預(yù)防組、玉桂片治療組、維C 預(yù)防組、維C 治療組酪氨酸酶含量降低，差異有顯著意義（P ＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血酪氨酸酶含量（±s）

表1 各組小鼠血酪氨酸酶含量（±s）

注：與模型對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組別 數(shù)量 血酪氨酸酶（u）空白對(duì)照組 8 1.442±0.674*模型對(duì)照組 8 14.414±3.273維C 預(yù)防組 8 8.491±0.848*維C 治療組 7 5.402±0.421*玉桂片預(yù)防組 7 4.025±1.007*玉桂片治療組 6 2.827±0.747*

3 討論

以黑色素為主沉積于皮膚所致的黃褐斑已逐漸成為影響女性美觀的重要原因。普遍認(rèn)為，其病因與紫外線、某些藥物、化妝品、微量元素異常、妊娠、內(nèi)分泌紊亂、失眠和遺傳等因素有關(guān)[11-13]。相關(guān)調(diào)查顯示[14]，隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活及工作壓力的增加，社會(huì)心理因素與黃褐斑的發(fā)病存在密切關(guān)系。以氫醌為基礎(chǔ)的三聯(lián)療法被視為黃褐斑的一線治療，其他治療方法包括維A 酸、曲酸、乙醇酸和抗壞血酸等藥物[15]。但是這些外用藥大多只是改變黃褐斑表面的顏色，且療效有限[16]。

中醫(yī)認(rèn)為，黃褐斑的發(fā)病主要與肝、脾、腎三臟密切相關(guān)，其常見(jiàn)病因是肝氣郁結(jié)、腎陰不足、腎陽(yáng)虧虛及脾胃虛弱等。昆明地處云貴高原，空氣稀薄干燥，易耗傷人體陰津，易損傷腎陰；晝夜溫差大，全年平均氣溫偏低，致使人體陽(yáng)氣既得不到充分生長(zhǎng)，又不能很好收藏，陽(yáng)氣外泄而易出現(xiàn)“陽(yáng)虛”證。久之，陰損及陽(yáng)，陽(yáng)虛之證加劇[17]。腎為先天之本，腎之陰陽(yáng)虧損，易引發(fā)其他臟腑的陰陽(yáng)虧損。陰津不足，易生虛火，虛火灼傷津液及氣血，故發(fā)為本病。

本次研究用玉桂片以治療肝腎不足所致的肝失疏泄，氣機(jī)不暢，肝郁氣滯，氣郁化火，灼傷陰血，血瘀成斑；腎氣不足，水液代謝失調(diào)，腎陰虧虛，虛火上炎，灼絡(luò)成痰，熏灼頭面成斑。方中主要成分有玉竹，肉桂。玉竹為補(bǔ)陰藥，養(yǎng)陰潤(rùn)燥，生津止渴；肉桂為溫里藥，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛，溫經(jīng)通脈，引火歸原。玉竹配肉桂補(bǔ)陽(yáng)益陰，陽(yáng)中求陰，補(bǔ)腎陰以養(yǎng)肝陰。玉竹味甘性微寒，肉桂味辛、甘性大熱，本方中玉竹與肉桂的用量是3 ∶1，使得本方溫補(bǔ)不致燥熱?？v觀全方具有滋陰潤(rùn)燥，溫經(jīng)散寒，滋養(yǎng)肝腎，溫補(bǔ)肝腎，以達(dá)到祛斑增白的作用。全方未刻意添加活血祛瘀等藥物，更是體現(xiàn)“治病求本”的用藥思想?，F(xiàn)代藥理研究表明[18、19]，玉竹在提高小鼠機(jī)體中超氧化物歧化酶的活性，改善小鼠體內(nèi)抗氧、清除自由基，提高SOD 活力具有顯著作用，從而能夠降低酪氨酸酶的含量。此外亦有研究顯示[20]，玉竹具有延緩衰老，肌膚美白有顯著功效。對(duì)于黃褐斑等皮膚類疾病皮膚形態(tài)發(fā)生異常，具有良好的修復(fù)作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃褐斑的發(fā)病機(jī)理極其復(fù)雜，與血酪氨酸酶活性增加密切相關(guān)。組織學(xué)特點(diǎn)主要是表皮中黑色素和黑素小體增加，黑素細(xì)胞活性增強(qiáng)，但真正改變黑素細(xì)胞功能的原因尚不清楚。而酪氨酸是黑色素合成的原始材料，在黑素小體內(nèi)酪氨酸酶的作用下經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)合成黑色素[21]。本次研究結(jié)果顯示，玉桂片在改善小鼠皮膚形態(tài)及降低血酪氨酸酶含量具有顯著作用，對(duì)于改善黃褐斑及預(yù)防黃褐斑有顯著療效。然本次研究?jī)H限于動(dòng)物研究，存在一定的局限性，對(duì)于玉桂片治療黃褐斑的作用機(jī)制有待今后進(jìn)一步深入探討。