胞外HMGB1在常見眼科疾病中的研究進展

周永瑩，李 軒,2

高遷移率蛋白家族(high mobility group box，HMGB)因其在電泳中的高遷移率而得名，其中對高遷移率蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)的研究最為深入。研究表明，胞外HMGB1作為損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)參與多種常見眼部疾病——干眼、角膜病、青光眼、葡萄膜炎、糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性的組織損傷修復的病理生理過程，從而對疾病的愈合產生負性影響。沉默胞外HMGB1的功能有望成為這些眼科疾病新的治療手段。本文就胞外HMGB1在常見眼科疾病中的研究進展作一綜述。

0 引言

高遷移率蛋白家族(high mobility group box，HMGB)首先在牛胸腺中被提取并鑒定，其中高遷移率蛋白1(high mobility group box1，HMGB1)廣泛分布于哺乳動物的組織中；在肝臟和大腦組織中，HMGB1集中分布在細胞的細胞質中，而在其他大多數組織中則分布在細胞核中[1]。胞內HMGB1作為進化高度保守的非組蛋白，其通過增強調節蛋白與基因的結合(調控線粒體質量和自噬的基因等)，對生命的維持起到至關重要的作用[2]。HMGB1可由受損細胞或免疫細胞被動或主動地釋放到胞外，胞外HMGB1作為損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)引起自身免疫反應和炎癥反應，進而加劇組織的損傷[3-4]。近年來，對胞外HMGB1的功能及其作用機制的研究已成為眼科疾病研究領域的熱點之一。本文將從胞外HMGB1的結構、功能及其在干眼、角膜病、青光眼、葡萄膜炎、糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性發生發展中的作用進行綜述。

1 HMGB1的結構與功能

HMGB1的基因位于13q12染色體上并轉錄合成含215個氨基酸的蛋白質，其分子量約為25kD[5]。HMGB1含有兩個折疊螺旋的DNA結合序列(A盒和B盒)以及含有一串谷氨酸和天冬氨酸的酸性尾巴(C尾)。A盒和B盒中的核定位序列中存在保守的賴氨酸殘基，其易被乙酰化，從而導致核排斥及HMGB1的釋放[6-7]。壞死或受損的細胞是被動地將HMGB1釋放到胞外，而激活的免疫細胞則可主動地將HMGB1釋放到胞外。胞外HMGB1通過與晚期糖基化終末產物受體[8-9]、Toll樣受體家族成員[10-11](TLR2、TLR4、TLR9)、CXCL12[12]、凝血酶敏感蛋白[13]等結合啟動NF-κB、ERK1/2、p38 MAPK、Src-家族激酶等相關的信號傳導通路，激活特定細胞分泌多種細胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6等)，干擾細胞內外信號調節，進而對細胞的增殖、分化、遷移以及損傷組織的炎癥反應、免疫反應產生復雜的生物學效應。另外，HMGB1具有3個特殊的半胱氨酸殘基，兩個位于A盒的23和45位置處，以及一個位于B盒的106位置處，其對氧化還原修飾十分敏感。研究表明，這3個半胱氨酸殘基的不同氧化還原形態決定了胞外HMGB1的不同生物活性[14]。胞外HMGB1刺激免疫細胞產生細胞因子的作用依賴于C23和C45由二硫鍵連接且處于氧化狀態，且C106必須保持硫醇形式的還原狀態[15]。這種獨特的分子構象使胞外HMGB1能夠與TLR4/MD-2復合物結合并發出信號，從而誘導巨噬細胞釋放相關的細胞因子。而當胞外HMGB1充當趨化介質時，其C23、C45和C106都必須保持硫醇形式的還原狀態[16]。這種全硫醇形式的HMGB1與CXCL12形成異源復合物后通過結合CXCR4對炎癥細胞產生趨化作用來啟動炎癥反應。值得注意的是，HMGB1的氧化還原修飾過程是可逆的，使得胞外HMGB1的功能可以從趨化因子轉變為細胞因子，反之亦然。當組織損傷時，胞外HMGB1通過相互排斥的氧化還原狀態之間的切換來協調白細胞的募集和募集后白細胞的激活，誘導細胞因子的分泌[16]。因此，胞外HMGB1氧化還原狀態的可修飾性使其能更好地協調白細胞的募集及其誘導炎癥細胞因子的分泌，進而更迅速地加劇損傷組織的炎癥反應。

2 胞外HMGB1與干眼

干眼是淚膜和眼表組織異常病變而導致的疾病。干眼常導致眼疲勞、異物感、干澀感、瘙癢和視力模糊，從而導致患者生活質量的下降。目前認為胞外HMGB1參與的炎癥反應是加劇干眼發生發展的重要因素[17]。

Lema等[17]在體內外建立的干眼模型中都證實當發生干眼時角膜內胞外HMGB1的表達明顯升高，但胞外HMGB1并不直接引起IL-6、IL-8、TNF-α的表達增加。干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)所致干眼患者的小唾液腺中發現其胞外HMGB1的表達水平增加，且組織檢查發現高HMGB1表達的同時還伴有大量單核細胞的浸潤。胞外HMGB1作為細胞因子與TNF-α和IL-1β一起形成促炎環加重SS中腺體的慢性炎癥反應[18]。同樣，其他學者的研究也證實，與有干燥癥癥狀或健康對照的患者相比，早期干燥綜合征患者的血清HMGB1水平顯著增加[19-20]。為了驗證沉默胞外HMGB1是否對干眼起治療效果，有學者通過使用2.5%的甘草甜素(HMGB1抑制劑)溶液點眼治療干眼，發現71.6%患者淚膜破裂時間和Schirmer評分都得到顯著的改善[21-22]。也有研究發現由干燥綜合征引起干眼的小鼠模型中對小鼠結膜下注射2μg或0.02μg HMGB1抗體來中和胞外HMGB1從而能夠減輕角膜缺損并增加淚液分泌，并且注射劑量為2μg時，引流淋巴結中ILC3s的百分比顯著增加，同時眶內腺中IL-22的表達也明顯增加[23]。由此可見，胞外HMGB1導致的異常炎癥反應可能是加重干眼的一個因素，而其抑制劑——甘草甜素溶液有望將來經過研發作為緩解干眼的藥物。

3 胞外HMGB1與角膜病

角膜是眼球前部最外層的組織，同時也是眼屈光成像中重要的屈光介質，其透明無血管的結構保證了外界光線進入眼內成像。近幾年的研究發現各類角膜病的發生、發展都與胞外HMGB1有著密切的聯系[24]。

目前，已有學者證實，當人角膜上皮細胞壞死時將釋放一系列警報素，包括IL-33、HMGB1、IL-1α等[25-26]。研究發現，壞死角膜上皮細胞的上清液將誘導上皮細胞中IκBα蛋白磷酸化和降解以及NF-κB的p65亞基向細胞核的轉位，還將使角膜成纖維細胞表達MMPs和TIMP[24,26]。在銅綠假單胞菌性角膜炎的動物模型中，胞外HMGB1通過RAGE和TLRs途徑激活中性粒細胞的遷移和炎性細胞因子的表達，進而加劇炎癥反應。甘草甜素通過降低胞外HMGB1的表達，能有效地減少角膜內中性粒細胞的浸潤和細菌量[27-28]。此外，McClellan等[29]報道，血管活性腸肽也能有效地降低銅綠假單胞菌性角膜炎小鼠模型中胞外HMGB1和促炎細胞因子的表達來改善愈后。沉默胞外HMGB1抑制了TLR4/RAGE-NF-κB通路從而降低IL-1β、MIP-2、TNF-α的表達。在真菌感染性角膜炎方面，Jiang等[30]研究發現，在煙曲霉角膜炎中，相比對照組，HMGB1的B盒能使巨噬細胞和中性粒細胞中LOX-1，IL-1β，TNF-α和MIP-2的表達升高，而LOX-1的抑制劑—Poly(I)能減輕其對巨噬細胞的促炎作用。Liu等[31]研究提示，HMGB1的B盒是通過TLR4/MyD88依賴的信號通路來介導煙曲霉引起的角膜炎癥。近年來，有學者在小鼠堿燒傷模型中發現損傷組織釋放的HMGB1是通過TLR4受體引起SDF-1的表達升高，從而促進內皮祖細胞的募集，導致新生血管的形成[32-33]。因此，在各種類型的角膜炎中，胞外HMGB1通過募集免疫細胞和誘導細胞因子的釋放產生過度的炎癥損傷，進一步惡化病情。相反，沉默胞外HMGB1則能減輕過度的免疫反應，減輕病情。

4 胞外HMGB1與青光眼

青光眼是全球導致視力喪失的主要眼病之一，僅次于白內障。臨床上將青光眼分為原發性青光眼、繼發性青光眼、發育性青光眼。目前關于胞外HMGB1與青光眼發病機制的研究在Pubmed上僅檢索出2篇文獻。Chi等[34]通過建立小鼠急性青光眼模型證實在眼壓快速升高6h后，視網膜組織中HMGB1的表達升高，且胞外HMGB1加劇視網膜缺血性損傷，導致RGC的丟失。該研究還表明，胞外HMGB1是通過誘導NLRP3, ASC, caspase-1和caspase-8-ASC炎性小體的表達升高，進而促進IL-1β的高表達，導致損傷加重。在Schallenberg等[35]研究中也證實眼內壓升高時視網膜中HMGB1的表達升高，同時還伴有鈣調蛋白，熱休克蛋白70和碳酸酐酶Ⅱ的變化。現階段，雖然胞外HMGB1在青光眼發病過程中的具體作用機制還不明確，但為現有的機制研究提供了一個新的研究線索。

5 胞外HMGB1與葡萄膜炎

葡萄膜基本的病理損害是葡萄膜的炎癥、腫瘤及退行性病變，其中以葡萄膜炎最為常見。葡萄膜炎的發病機制復雜多樣，除感染性因素外，多數葡萄膜炎的發病機制都與自身免疫反應相關。隨著免疫學的發展，胞外HMGB1在葡萄膜炎中的研究正在逐步深入。

最早在1990年，Wittemann等[36]研究發現，在32例關節炎發作同時伴有葡萄膜炎患者中，8例(25%)患者的血清中發現抗HMGB1或抗HMGB2的抗體，這提示胞外HMGB1參與自身免疫反應。隨后，在建立的大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜視網膜炎模型中，Watanabe等[37]證實房水中HMGB1水平顯著升高，且胞外HMGB1通過RAGE受體刺激骨髓來源的巨噬細胞釋放TNF-α，進而加劇眼部的炎癥反應，HMGB1和TNF-α的水平與眼部炎癥嚴重程度相關。更深入的研究表明，在自身免疫性葡萄膜炎中，胞外HMGB1的釋放需要視網膜細胞和IRBP特異性T細胞相互接觸后由視網膜細胞釋放，并且通過TLR/MyD88信號通路刺激IRBP特異性T細胞產生IFN-γ和IL-17[38-39]。然而，Jiang等[40]則認為胞外HMGB1是通過Fas/FasL炎癥信號通路來觸發炎癥反應。Yun等[41]研究則表明IRBP特異性T細胞引發眼內炎癥的早期階段，胞外HMGB1與CXCL12的協同作用是促進炎性細胞浸潤的關鍵因素。此外，另一些研究則表明，當發生葡萄膜炎時可使胞外HMGB1的表達升高，但胞外HMGB1的表達水平與疾病活動或治療之間沒有顯著地相關性[42-45]。綜上，胞外HMGB1可誘導免疫細胞產生炎癥反應加劇葡萄膜炎的自身免疫反應，但胞外HMGB1具體通過何種分子機制途徑來惡化病情還未完全明確，還需更深入的研究來明確。

6 胞外HMGB1與糖尿病性視網膜病變

糖尿病性視網膜病變是與持續高血糖及其他與糖尿病聯系的狀態(如高血壓)相關的一種慢性、進行性、潛在危害視力的視網膜微血管疾病[46]。其不同階段的特征表現為視網膜內皮細胞功能障礙，血-視網膜屏障損傷，缺血和視網膜新生血管形成。糖尿病性視網膜病變的病因尚不完全明了，炎癥因子介導的視網膜和視神經損傷在其中起到了一定的作用[47-48]。

臨床研究中，El-Asrar等對8例增殖性糖尿病視網膜病變患者(proliferative diabetic retinopathy,PDR)和13例增殖性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)患者的非活動性膜進行了研究,發現4例PDR膜中的血管內皮細胞、基質細胞分別表達HMGB1、RAGE、OPN和Egr-1，而13例PVR膜中肌成纖維細胞表達α-SMA的同時全部都表達HMGB1，RAGE，OPN和Egr-1，這些結果提示HMGB1/RAGE/OPN/Egr-1途徑可能參與增殖性玻璃體視網膜疾病的炎癥，血管生成和纖維化反應[49-50]。隨后，Abu El-Asrar等[51]進一步證實HMGB1，OPN和CTGF是促進增生性玻璃體視網膜疾病發生發展的重要因素。另外，Fu等[52]報道，在糖尿病視網膜病變患者的血清中HMGB1和VEGFA的表達都上調，證明胞外HMGB1和VEGFA是抑制視網膜色素上皮細胞活力和誘導細胞凋亡的關鍵因素。近年來，一些學者的臨床研究都表明胞外HMGB1通過多種途徑對糖尿病視網膜病變的進展起到負面作用，如氧化應激反應、Th17相關細胞因子等[39,53-54]。

基礎研究中，Yu等[55]通過建立糖尿病大鼠模型發現胞外HMGB1可能通過結合RAGE受體加速大鼠視網膜細胞的凋亡。此外，高糖處理后的周細胞出現HMGB1的易位，且RAGE和NF-κB的活性表達也增加，提示胞外HMGB1對視網膜的損傷依賴于RAGE的表達和NF-κB的激活[56-57]。也有學者發現胞外HMGB1能夠使視網膜色素上皮停滯在G1細胞周期，從而抑制視網膜色素上皮的生長，且胞外HMGB1能觸發Akt、p38 MAPK和NF-κB的過度磷酸化，進而上調視網膜色素上皮細胞表達VEGF、bFGF、TGF-β2和CTGF[58]。為了證實沉默胞外HMGB1的功能在糖尿病性視網膜病變中的作用，Jiang等[59]通過在玻璃體腔注射HMGB1 siRNA來降低高糖誘導的HMGB1蛋白和mRNA的表達水平，進而下調的胞外HMGB1表達能減少視網膜細胞的凋亡以及增加細胞活力。也有研究使用甘草甜素來抑制胞外HMGB1對視網膜Müller細胞中pSTAT-3核轉位的誘導作用，從而降低糖尿病視網膜中VEGF的表達[60]。另外，甘草甜素可與Epac1共同作用來降低急性糖尿病視網膜損傷時的炎癥反應，進而減輕神經元和血管損傷[61]。

綜上,在臨床研究和基礎研究中均表明胞外HMGB1參與糖尿病性視網膜病變的發生發展過程，沉默胞外HMGB1的功能能有效地減輕視網膜上皮細胞和視神經元的損傷。

7 胞外HMGB1與年齡相關性黃斑變性

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種黃斑變性疾病，雙眼先后發病或同時發病，且進行性損害視力，其病變累及視網膜色素上皮、感光細胞層和脈絡膜。

近年來研究表明，視網膜色素上皮細胞壞死和光感受器細胞凋亡是晚期干性ARMD的特征,而氧化應激是誘導視網膜色素上皮細胞壞死的重要因素[62]。當視網膜色素上皮細胞壞死時，HMGB1發生轉位并釋放到胞外，胞外HMGB1誘導正常視網膜色素上皮細胞和THP-1細胞表達TNF-α，加重細胞損傷[63-64]。新生血管形成是濕性ARMD的常見問題，Lee等[65]研究發現，使用丙酮酸乙酯抑制視網膜中過表達的HMGB1能夠預防視網膜新生血管形成。同樣，Murakami等[66]證實在干性ARMD中通過抑制胞外HMGB1的釋放能夠減輕視網膜的炎癥反應。但目前，胞外HMGB1在ARMD的發生發展中具體致病機制的研究結果尚少，還需更多的研究結果來進一步闡明。

8 總結與展望

目前，胞外HMGB1在常見的眼科疾病中進行了有益的研究探索，對有關疾病的發病機制提供了新的研究方向。但是，胞外HMGB1是如何具體地調控疾病的發病進展則還需更深入的研究來闡明。繼續探索胞外HMGB1的調控機制，并設計特定的藥物，將成為未來胞外HMGB1與眼部疾病研究的主要方向，并為眼科疾病的防御和治療提供更為廣泛的前景。