分泌粒蛋白Ⅲ抗體治療眼底新生血管的研究進展

楊彬彬,靳 荷,丁芝祥

分泌粒蛋白Ⅲ(Secretogranin Ⅲ，Scg3/SgⅢ)是一個新近發現的血管生長因子，相關體內、體外研究已證實Scg3在眼底新生血管的形成中具有重要作用。近年來，將Scg3抗體應用于眼底新生血管的治療也取得了一些進展，其作用機制與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)不同，Scg3僅在病理性新生血管中表達，在正常血管中不表達，是一種新發現的具有高選擇性表達的血管生長因子。本文從Scg3分子結構、信號傳導通路以及其在眼底視網膜及脈絡膜新生血管治療中的最新進展進行了綜述，旨在為視網膜及脈絡膜新生血管的治療提供一個新的治療思路。

0 引言

目前眼底的新生血管性疾病——濕性年齡相關性黃斑病變(wet age-related macular degeneration，wARMD)、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)等是常見的致盲性眼病，根據Nangia等[1]調查研究顯示，在全球范圍內，wARMD在致盲性眼病中致盲率達11.72%，DR的致盲率為2.75%，ROP在兒童致盲眼病中為18%[2]。目前針對視網膜新生血管性疾病治療方法主要包括手術治療、冷凍治療、視網膜激光光凝及光動力療法、抗VEGF等，抗VEGF的應用對治療視網膜及脈絡膜新生血管性疾病取得了突破性的進展，然而，其治療效果依然有限，我們需探索更為安全有效的治療方式。分泌粒蛋白Ⅲ(Secretogranin Ⅲ，Scg3)最早在1990年在小鼠神經元中作為一種神經蛋白被發現[3]，后來逐漸發現其還在視網膜神經元中表達，新近Li等的研究發現Scg3是一種具有高度特異性表達的血管生長因子[4]；抑制Scg3的表達可以選擇性抑制病理性新生血管，而不影響正常的血管生長，對視網膜新生血管及相關脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的治療有著重要的研究意義[5]。本文從Scg3的生物學特性、分子結構、信號傳導通路及Scg3在視網膜及脈絡膜新生血管中的研究進展進行綜述，旨在為視網膜及脈絡膜新生血管的治療提供一個新的治療思路。

1 Scg3家族

分泌粒蛋白Ⅲ(Scg3/SgⅢ)屬于顆粒細胞家族，由嗜鉻粒蛋白A(Chromogranin A，CgA)、嗜鉻粒蛋白B(Chromogranin B，CgB)和分泌粒蛋白2～7[6]、以及其他相關蛋白(7B2，NESP55，proSAAS和VGF)[7]組成。顆粒細胞家族來源的多肽包括有自分泌、旁分泌及內分泌信號，可以反饋刺激致密核心大囊泡從而形成調節激素和生長因子,進而參與調節多種生物活性，包括分泌、代謝、血管穩態、心功能、血壓、細胞免疫及先天免疫等[7-10]。

Kingsley等[11]研究發現，Scg3為小鼠1B1075基因的產物，然而缺失1B1075基因的小鼠在生存、生育和運動行為方面均沒有明顯的影響。或許正是由于Scg3基因的缺失對小鼠的行為改變并沒有明顯的影響，在早期其并沒有像其他的顆粒細胞家族成員一樣被深入研究。所以，Scg3是顆粒細胞家族中被研究最少的因子之一，最近Li等的研究發現，Scg3是一種新的血管生長因子，具有高選擇性表達的特點，可以選擇性的誘導小鼠的糖尿病視網膜血管生成，而不影響正常的毛細血管[5]。所以，Scg3的作用機制與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)也存在一定差異，VEGF在小鼠的糖尿病視網膜血管和正常血管中均表達，能夠同時刺激兩者的血管內皮細胞生長。

2 Scg3的分子結構

Scg3基因位于人類15q21染色體上，由12個外顯子和11個內含子組成，是一種親水性酸性氨基酸，3366bp SgⅢ mRNA編碼468個氨基酸——由7對連續的基礎氨基酸組成[7,12]。Scg3還是一種N-糖基化蛋白，在分泌囊泡中可以水解為中等大小的蛋白[13]。最早在1990年的研究中，在小鼠神經元中發現Scg3表達為一種神經蛋白[3]，后來逐漸發現其主要表達于內分泌細胞、神經內分泌細胞以及神經元中，包括有視網膜神經元[3,5,14-16]，同時，在小鼠垂體瘤細胞(ArT-20)中，Scg3在轉運高爾基體(trans-golgi network，TGN)中與富含膽固醇的膜結合而成分泌顆粒[10]。

Scg3分子(471 aa)由3個功能域組成，分別為膽固醇結合域(Scg3 23-186)、CgA結合域(Scg3 214-373)和羧肽酶e(carboxypeptidase e，CPe)結合域(Scg3 374-471)[17]。Scg3作為CgA的特定結合分子伴侶[14]，Scg3與CgA等顆粒細胞家族成員一起參與調控分泌家族的神經肽激素、神經遞質的分泌[17]。通過Northern Blot，Scg3和CgA在腦、下垂體和神經內分泌組織中共同表達，而在非神經內分泌組織中不表達，將CgA結合域從Scg3序列中剔除，也并不影響Scg3在細胞內的轉運至分泌顆粒中[14]。同時，在顆粒內，Scg3能夠與分泌顆粒膜(secretory granule membrane，SGM)型脂質體結合，而CgA則不能，CgA只能在和Scg3共存時與SGM型脂質體結合，并且，Scg3與脂質體結合活性在一定程度上與膽固醇的比例成正比，在膽固醇比例為60%時達到最佳[10]。所以，Scg3通過不同的結構域，可以與CgA和膽固醇同時結合。

3 Scg3的信號傳導通路

Scg3作為新近發現的新生血管因子，目前對于其信號傳導通路的機制還有待進一步研究。依據Tang等[18]研究，Scg3能夠誘導有絲分裂蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)/胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)發生磷酸化，促進內皮細胞增殖、遷徙，有效地激發新生血管生長。MEK/ERK信號通路對于Scg3誘導的促進新生血管形成細胞內信號具有重要意義。Scg3與VEGF類似，已有相關研究指出MEK/ERK信號通路通過促進內皮細胞的增殖、遷徙，對VEGF介導的信號轉導和血管生成反應具有重要意義[19-21]，但Scg3與VEGF都通過MEK/ERK信號通路進行轉導并激活Src的磷酸化，發揮新生血管生成和血管滲漏作用；但是，兩者最初反應結合的反應受體不同，在細胞內的信號通路也完全不同[22]。VEGF誘導MEK、ERK、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、Src和信號傳導與轉錄活化因子(signal transducers and activators of transcription，Stat3)的磷酸化；Scg3主要激活MEK、ERK和Src的磷酸化[5]。此外，VEGF主要由3個受體，分別為VEGFR 1、2和3，VEGFR1主要作用是促進血管內皮細胞的遷移，VEGFR2為促進血管生成和提高血管滲漏性的主要受體[23]，VEGFR3參與淋巴管的生成[24]，Scg3既不與VEGFR1或VEGFR2結合，也不能激活VEGFR2[5]。由此表明，Scg3與VEGF可能是通過不同的信號通路部分差異性的發揮新生血管生成和血管滲漏的作用。而目前對于Scg3的受體尚未被識別，依據Tang等[18]研究表明MEK/ERK為Scg3的關鍵性信號通路，而MEK/ERK可以被不同的受體激活，如受體絡氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)、G蛋白偶聯受體(G proteincoupled receptors，GPCR)和整合素[25]，因而考慮Scg3受體可能位于RTK、GPCR或整聯蛋白中，也對進一步研究Scg3的機制奠定基礎。

4 Scg3在視網膜及脈絡膜新生血管中的作用

4.1 Scg3與糖尿病視網膜病變 糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的常見并發癥之一，也是目前導致工作年齡人群視力損傷的主要原因之一，據統計，在全球糖尿病患者中DR的患病率約為34.6%(約9300萬人)[26]。目前，抗VEGF治療是DR的主要治療方式之一，但經過多年的臨床應用，抗VEGF對DR的治療效果仍相當的有限[27-28]，同時，反復的玻璃體腔注藥可能會引起角膜水腫、視網膜脫離、視網膜纖維化、脈絡膜毛細血管萎縮、視網膜神經退行性變、眼壓升高、非感染性眼內炎、白內障、黃斑區瘢痕形成等并發癥[29-31]。LeBlanc等經過研究證實，Scg3在糖尿病視網膜血管中高度特異性表達，特異性高達97.69%，而在正常周邊毛細血管中無特異性表達，同時，Scg3受體在糖尿病新生視網膜血管內皮細胞中顯著升高[22]。血糖升高可以通過活性氧激活谷氨酰胺轉化酶2誘導視網膜血管滲漏[32]，LeBlanc等的研究發現，然而Scg3單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)在糖尿病視網膜病變的小鼠模型中，具有抑制病理性視網膜新生血管形成和減少視網膜血管滲漏的作用[5]，而不影響視網膜周邊正常的毛細血管。在小鼠模型研究中，發現Scg3 mAb可以通過眼球筋膜下注射的方式給藥，達到同樣的眼底治療效果。能夠有效地避免玻璃體腔注藥的并發癥的發生，加上Scg3在糖尿病血管的高選擇性表達的特點，有望成為新的治療糖尿病視網膜病變的藥物。

4.2 Scg3與早產兒視網膜病變 早產兒視網膜病變(ROP)以視網膜血管異常增生為特征，其主要危險因素包括胎齡、出生體質量、吸氧、機械通氣等[33]。目前激光光凝術仍然是治療ROP的首選治療方式。2007年抗VEGF藥物首次被用于治療ROP[34]，然而經過多年的研究及臨床應用，抗VEGF藥物在治療ROP上療效有限[35-36]，而且抗VEGF藥物可能經過眼部周圍的組織滲透到全身循環，可能會阻礙患兒大腦、肺、腎和其他周邊血管的生成，從而影響患兒生長發育[37-39]，相對于成年人的治療，針對新生兒的治療要求的不僅僅是短時的治療效果，更需要在未來更長時間都可以取得良好的療效，并且盡可能的將副作用或并發癥降到最低。傳統的冷凍治療及激光光凝雖然都可以降低ROP的致盲率，但兩者均以犧牲周邊視力為代價，治療后患者大多視力仍不佳，甚至可能伴有并發癥，如眼底血管迂曲、視盤顳側近視弧形斑、玻璃體極化膜、外周牽拉性視網膜脫離等[40]。

最近Tang等[4]在新生小鼠的研究中發現，抗Scg3對緩解氧誘導視網膜病變(oxygen induced retinopathy，OIR)具有高效性與安全性。通過誘導新生小鼠產生OIR，再分別在玻璃體腔內注射阿柏西普(Aflibercept)、Scg3 mAb，結果顯示阿柏西普雖然也能顯著抑制視網膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)和新生血管簇及其分叉點，但僅能輕度改善視網膜中心缺血區；而Scg3 mAb不僅可以顯著地抑制RNV和新生血管簇奇跡分叉點，還能顯著改善視網膜中心無血管區[4]。因而可以證實Scg3 mAb對治療ROP的有效性。同時，因為抗VEGF藥物會滲透到全身循環中[37]，引起新生兒體質量增長遲緩、腎小球擴張等并發癥，所以，Tang等[4]在進一步研究中驗證了Scg3 mAb的安全性，應用Scg3 mAb的新生小鼠體質量能夠正常增長，并未導致腎小管發育異常或腎小管損傷等，腎臟組織結構及功能均無明顯異常，也進一步說明了抗Scg3在治療ROP上的高度安全性。

Scg3由于其高選擇性表達的特性，優先在病變血管而非正常血管，對發育中的視網膜以及其他器官的副作用最小，所以，抗Scg3治療OIR具有高度的安全性和有效性，可能可以在將來應用于ROP的治療中。

4.3 Scg3與脈絡膜新生血管 脈絡膜新生血管(CNV)是指脈絡膜毛細血管的增殖血管，因其常累及黃斑部，引起黃斑區反復的出血、滲出、瘢痕形成，損害患者的中心視力，影響生活質量，同時，CNV也是眼內血管性疾病的共同臨床表現。在傳統抗VEGF的治療中，抗VEGF藥物不僅僅能夠抑制脈絡膜新生血管的生長，也在一定程度上影響脈絡膜的正常毛細血管。LeBlanc等[41]研究了Scg3在CNV中的作用，Scg3能夠誘導內皮細胞的增殖、遷徙，參與調節血管生成和血管滲漏[22]。Scg3在小鼠的糖尿病血管中高度特異性表達，而在正常血管不表達，對抗Scg3治療CNV具有重要研究意義[5]。LeBlanc等[41]通過氬激光或基質膜誘導小鼠產生CNV，在分別注射Scg3 pAb、Scg3 mAb、阿柏西普，結果顯示Scg3 pAb、Scg3 mAb均能顯著降低CNV的病變范圍，依據CNV的三維體積、病灶面積及血管密度顯示，Scg3 pAb、Scg3 mAb對CNV均具有顯著的抑制作用，其效果與阿柏西普相似。為了避免玻璃體腔注藥帶來的副作用，LeBlanc等[41]采用全身給藥的方式注射Scg3 pAb、Scg3 mAb，結果顯示和玻璃體腔注藥達到了同樣的療效。

4.4 Scg3與濕性年齡相關性黃斑病變 年齡相關性黃斑病變(age-related macular degeneration，ARMD)是發達國家老年人致盲的主要原因。預計到2020年將會有1.96億例的ARMD患者，到2040年將會增長至2.88億，其中亞種病例數最高(達1.13億)[42]。臨床上將ARMD分為兩類：干性(萎縮性)ARMD和濕性(新生血管性)ARMD[43]，wARMD對視力的損害程度遠高于干性ARMD，其特點是黃斑區CNV伴視網膜腔內或視網膜下新生血管滲漏、出血和視網膜色素上皮層脫離[44]，黃斑區出血、水腫甚至瘢痕形成，導致視力下降。wARMD的損害主要發生在視網膜色素上皮層，其中炎癥、氧化應激和血管改變以及潛在脈絡膜的灌注減少是促血管生長因子產生增加的原因，從而引起新的病理性新生血管[45-46]，新生血管通過Bruch膜進入視網膜下腔生長，這種異常的新生血管主要是由血管內皮生長因子引起的[47]，因此，血管內皮生長因子抗體的應用可以有效地治療wARMD。

年齡相關性黃斑病變的發病機制目前考慮主要與血管內皮生長因子信號與新生血管形成相關的機制、氧化應激、自噬、線粒體DNA的損傷等有關[48-50]。目前均有針對這些機制而采取的治療措施。雷珠單抗、阿柏西普等抗VEGF藥物治療雖然給ARMD患者帶來了突破性的研究進展，然而，抗VEGF治療并不能從根本上改變疾病的進程或預防疾病的發展，只能延緩其進展[48]，且抗VEGF治療對于黃斑中心凹萎縮的干性ARMD患者無效，長期的抗VEGF治療可能會破壞黃斑區功能結構致地圖樣萎縮和纖維化[51-53]。

Scg3目前作為一種新近發現的血管生長因子被廣泛研究；LeBlanc等研究發現Scg3與VEGF具有不同的受體，為Scg3抗體可以作為wARMD的替代治療或聯合治療以提高治療效果提供實驗基礎[18]。在動物實驗中，抗Scg3治療可以有效地抑制視網膜血管內皮細胞中Scg3誘導的增殖和Src磷酸化；玻璃體腔內或皮下注射Scg3 mAb均能顯著減低激光或基底膜誘導的CNV滲漏、CNV病變面積及血管密度[41]。同時，皮下注射的給藥方式能有效地避免玻璃體腔內主要可能帶來的并發癥與風險[41]。LeBlanc等研究還發現，Scg3 mAb對發育中的視網膜以及其他器官的副作用最小[4]，相比VEGF而言具有更高的安全性和有效性，所以，抗Scg3有望成為第一個在內皮細胞配體引導下，高選擇性靶向治療CNV的血管生成抑制劑。

5 總結與展望

綜上所述，抗Scg3治療在治療眼底視網膜及脈絡膜新生血管中具有重要作用。近年來對Scg3的深入研究，對了解Scg3的生物構成及其作用機制具有重要意義。目前的動物研究表明抗Scg3在治療眼底視網膜及脈絡膜新生血管上副作用最小，安全性最高，但其長期的安全性還有待進一步研究。我們還可以推測抗Scg3治療不僅對治療ROP有效，甚至有望治療其他新生血管性疾病，例如角膜新生血管、視網膜靜脈阻塞、新生血管性青光眼等，同時也將更加全面地深入研究Scg3的生物學功能及其作用機制。