lncRNA-miRNA與膠質(zhì)瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展

柴洋 綜述 謝明祥 審校

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 遵義 563003)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中最具侵襲性的原發(fā)性腫瘤是神經(jīng)膠質(zhì)瘤，約占所有侵襲性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的50%～80%[1]并且逐年遞增[2-3]。其中，WHO定義為Ⅳ級的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)，約80%為浸潤性星形細(xì)胞瘤，是目前病理診斷級別惡性程度最高的惡性膠質(zhì)瘤。人類基因組中98%以上的核苷酸序列不編碼蛋白質(zhì)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為ncRNA(ncRNA)。各種研究表明，ncRNA據(jù)片段大小劃分出來的微小RNA (miRNA)和長鏈非編碼RNA (lncRNA)，這兩種RNA調(diào)控多種蛋白編碼基因。lncRNA可以作為分子誘餌，通過直接吸附miRNA來有效抑制miRNA與靶mRNA的相互作用。本文主要對lncRNA-miRNA與膠質(zhì)瘤作用機(jī)制作一綜述。

1 lncRNA及其功能

1.1lncRNA 自20世紀(jì)90年代以來，Okazaki等對老鼠的全長cDNA進(jìn)行大規(guī)模測序時發(fā)現(xiàn)了lncRNA到在老鼠中發(fā)現(xiàn)了H19和X(染色體)失活特異性轉(zhuǎn)錄物(Xist)，隨著越來越深入的研究，過去被當(dāng)做“克隆文物”或者轉(zhuǎn)錄“噪音”的lncRNA重新獲得了人們的重視[4]。經(jīng)科研人員多年的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的長度超過200個核苷酸(nt)，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄合成，但lncRNA不參與蛋白質(zhì)的翻譯過程且具有空間和時間的特異性。除了表達(dá)水平很低，核苷酸的數(shù)量比較少以及外顯子雖然長度更長但數(shù)量少以外，其他很多方面都與mRNA的序列類似[5]，同樣包含5’端帽結(jié)構(gòu)，3’端多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)，內(nèi)含子以及剪接位點(diǎn)。

多數(shù)lncRNA的二級結(jié)構(gòu)相對保守，具有獨(dú)特的剪接形式以及特定的亞細(xì)胞定位，這種空間和時間的特異性可以說明lncRNA是具有許多功能的,但這種功能特性相對于許多miRNA和蛋白質(zhì)來說很難完全確定。根據(jù)lncRNA相對于蛋白編碼基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的位置，可將其分為六類lncRNA：①Sense lncRNA(正義鏈RNA)：與編碼基因的一個或多個外顯子重疊；②Antisense lncRNA(反義鏈RNA)：與互補(bǔ)鏈上的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行部分或完全的互補(bǔ)；③Intronic transcript lncRNA(內(nèi)含子lncRNA)：由基因的內(nèi)含子產(chǎn)生；④Bidirectional lncRNA(雙向lncRNA)：由與蛋白編碼基因相同的啟動子轉(zhuǎn)錄而來，但是方向相反； ⑤Long intergenic noncoding RNA(長基因間lncRNA，lincRNA)：由位于蛋白質(zhì)編碼基因之間的序列獨(dú)立轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生；⑥Enhancer lncRNA(增強(qiáng)子lncRNA)：由位于增強(qiáng)子區(qū)域的蛋白編碼基因產(chǎn)生。根據(jù)lncRNA在腫瘤發(fā)生及其發(fā)展過程中所發(fā)生的作用，可將lncRNA劃分為癌基因以及抑癌基因lncRNA。值得注意的是，目前是不能僅根據(jù)序列特征或者結(jié)構(gòu)形式來準(zhǔn)確推測它們在其基因調(diào)控中所起的作用。

1.2lncRNA的功能 lncRNA不僅僅維持正常生理過程，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的關(guān)系也被廣泛報(bào)道，因此成為近期的研究熱點(diǎn)。在表觀遺傳學(xué)水平上，可通過DNA甲基化、介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的正常表達(dá)。在轉(zhuǎn)錄水平上，位于啟動子區(qū)的編碼基因轉(zhuǎn)錄生成的lncRNA，可作為順勢作用原件去干擾下游基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響mRNA的生成。另外，lncRNA可直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)錄因子因其活性降低而無法與目標(biāo)基因結(jié)合，進(jìn)而抑制了目標(biāo)基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)錄后水平上，lncRNA通過與miRNA的前體(pre-miRNA)結(jié)合并進(jìn)行配對，從而形成雙鏈復(fù)合物，影響其剪接、核內(nèi)運(yùn)輸以及降解等來調(diào)控基因的表達(dá)。lncRNA也可誘導(dǎo)某些基因位點(diǎn)形成異染色體，從而引發(fā)染色體重塑進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。

lncRNA因其不僅具有功能保守和調(diào)控嚴(yán)格的特性，還由于其空間和時間的特異性，使得lncRNA在正常生長發(fā)育以及某些惡性疾病的發(fā)生早期及其發(fā)展中都能起著重要的調(diào)控作用。從在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了H19和Xist，直到最近十年，lncRNA在在癌癥發(fā)展中的作用才被提出來[6]，由于在體液中很容易檢測到lncRNA，因此lncRNA作為癌癥早期診斷、預(yù)后和癌癥治療的關(guān)鍵生物標(biāo)記物尤其具有可觀的應(yīng)用前景研究意義[7，8]。

2 miRNA及其功能

2.1miRNA 自1993年Lee等人在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的第1個miRNA到2001年Ambros實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)造了miRNA這個術(shù)語再到let-7的發(fā)現(xiàn)，就此展開了對miRNA的研究。miRNA在真核生物中廣泛存在，長度僅為18～25個nt，與lncRNA相同，都不參與蛋白質(zhì)的翻譯過程即都是不編碼蛋白質(zhì)的RNA。miRNA必須經(jīng)過一個從初級(pre-)到前體(pri-)最后成熟的過程。首先，在細(xì)胞核中，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄生成加帽和多聚腺苷酸尾的初級miRNA(pri-miRNA)。接著pri-miRNA被酶-蛋白復(fù)合體：RNase Ⅲ DROSHA-DGCR8剪切成前體miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA是3’端有2個nt突出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。然后生成的pre-miRNA經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5-RanGTP轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)后，最后被RNase Ⅲ DICER再次切割生成5’端有磷酸基團(tuán)，3’端是羥基的成熟miRNA[9]。 多數(shù)miRNA序列高度保守，具有時間、空間、組織[10]以及疾病特異性。

2.2miRNA的功能 miRNA可調(diào)控約1/3的人類基因，多數(shù)成熟的miRNA與人類蛋白質(zhì)AGO2結(jié)合并可以生成一種基因沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex，RISC)[9]，RISC通過miRNA 5’端的核苷酸序列與靶mRNA 3’端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)特異結(jié)合后，可阻止靶基因的翻譯或直接降解靶基因。少數(shù)成熟的miRNA并不通過阻遏mRNA的翻譯行使調(diào)控作用，而是通過與核糖體蛋白mRNA的5’-UTR結(jié)合來促進(jìn)核糖體蛋白合成。迄今為止，所有研究均表明miRNA在干細(xì)胞分化、發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移耐藥中發(fā)揮著強(qiáng)大的基因調(diào)控作用，因此，miRNA可以作為診斷、預(yù)后和治療的生物標(biāo)記物[11]。miRNA因具有組織特異性而同時既可作為癌基因，又可作為抑癌基因。在耐藥方面，miRNA可通過影響細(xì)胞自噬，導(dǎo)致靶基因表達(dá)自噬蛋白減少并增加細(xì)胞毒性起作用。并且經(jīng)研究證明miRNA干預(yù)多條經(jīng)典信號通路發(fā)揮其基因調(diào)控的作用，如作用于經(jīng)典的p53和Wnt-β-catenin。

3 lncRNA與miRNA的相互作用

3.1lncRNA調(diào)控miRNA

3.1.1lncRNA作為miRNA的前體或宿主 pre-miRNA可通過lncRNA經(jīng)細(xì)胞內(nèi)剪切，或者其他基因在轉(zhuǎn)錄生成lncRNA的同時轉(zhuǎn)錄生成，但要獲得成熟的miRNA，還需要進(jìn)一步的加工才能發(fā)揮作用。H19的加工產(chǎn)物miR-675，其堿基主要是C和G，而H19的堿基主要是G。雖然miR-675的前體是H19，但其兩者的序列、核苷酸組成有所不同，這可能是發(fā)揮不同功能所需要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[12]。

3.1.2lncRNA與miRNA競爭性結(jié)合mRNA lncRNA和miRNA可競爭性與靶mRNA的3’UTR結(jié)合,進(jìn)而抑制miRNA對靶基因的負(fù)向調(diào)控作用。β分泌酶編碼基因1(BACE1)是一種膜結(jié)合的天冬氨酸蛋白酶。能轉(zhuǎn)錄出一條長約2kb的Antisense lncRNA(BACE1-AS)。BACE1-AS水平上調(diào)增加BACE1的穩(wěn)定性，并與BACE1 mRNA競爭性結(jié)合以抑制miR-285-5p結(jié)合并沉默BACE1的作用。

3.1.3lncRNA作為miRNA的海綿或者誘餌 lncRNA作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)以誘餌的方式吸附特定的miRNA，miRNA與lncRNA結(jié)合后既可通過順式作用直接作用于該lncRNA，也可通過反式作用間接作用于其他RNA，進(jìn)而間接抑制miRNA靶基因表達(dá)的這種方式被稱為“海綿效應(yīng)”(miRNA sponge)，lncRNA稱為“分子海綿”。

在經(jīng)典的lin28/let-7信號通路中，lin28與let-7的前體結(jié)合。lin28有兩個高度保守的結(jié)合RNA的結(jié)構(gòu)域，一個是位于氨基末端的冷休克結(jié)構(gòu)域(CSD)，另一個是位于羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)域(ZKD)，ZKD由兩個串聯(lián)的 CCHC(Cys-Cys-His-Cys)組成。pre-let-7 preE的loop環(huán)繞lin28的CSD，pre-let-7的3’-stem GGAG模體與lin28的ZKD結(jié)合后，lin28抑制let-7成熟從而實(shí)現(xiàn)lin28對let-7的抑制。

3.2miRNA調(diào)控lncRNA miRNA通過直接或間接作用于lncRNA，降低lncRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)lncRNA并影響生物進(jìn)程。由于lncRNA也有3’UTR，因此miRNA可像作用與mRNA一樣與lncRNA的3’UTR結(jié)合從而直接抑制lncRNA。miRNA也可通過調(diào)節(jié)DNA甲基化酶(DNA methylase，DNMT)間接對lncRNA起調(diào)控作用。

4 linRNA-miRNA與膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制

雖然lncRNA與miRNA都可單獨(dú)作用于mRNA，但兩者的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并不是相互獨(dú)立的。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中，lncRNA與miRNA的調(diào)控機(jī)制相互交織，并以依存的關(guān)系共同形成一個龐大的調(diào)控環(huán)路。

H19是母源性印跡基因，既有致癌又有抑癌的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，H19及由其衍生的miRNA-675在一些高級別惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)量明顯要高于低級別惡性膠質(zhì)瘤。H19通過其生成的miRNA-675促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲作用。更有實(shí)驗(yàn)證實(shí)：抑制H19將抑制膠質(zhì)瘤。熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測到H19過表達(dá)以及miR-140下調(diào)，說明miR-140作為H19的靶點(diǎn)發(fā)揮促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用[13]。血管生成抑制蛋白2(VASH2)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)共同調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤血管的生成。VASH2通過H19-miR-29a通路上調(diào)以促進(jìn)膠質(zhì)瘤血管的生成。

母系表達(dá)基因3(MEG3)是一種抑制腦腫瘤的lncRNA，在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)低于正常大腦組織。miR-19a主要發(fā)揮是其作為致癌基因的作用，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲。PTEN基因(PTEN)，又稱為MMAC1和TEP1。miR-19a通過抑制PTEN起作用。MEG3通過抑制miR-19a的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期[14]。此外，miR-93在膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，可通過磷脂酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(P13K/AKT)信號通路促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤的早期發(fā)生及其發(fā)展，MEG3可通過抑制miR-93，進(jìn)而抑制P13K/AKT信號通路最終發(fā)揮抑制惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生的作用[15]。

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)是一種核內(nèi)lncRNA，最初在研究其與人體肺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系時才被發(fā)現(xiàn)。與正常人大腦神經(jīng)組織相比，在惡性膠質(zhì)瘤中顯著升高，并與腫瘤惡性程度、大小成正比，與膠質(zhì)瘤患者的總生存期(OS)成反比。MALAT1通過抑制miR-101增加其靶基因STMN1、RAB5A以及ATG4D的表達(dá)。即通過MALAT1-miR-101-STMN1/RAB5A/ATG4D調(diào)控網(wǎng)絡(luò)激活膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬，并通過上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STMN1、RAB5A和ATG4D的表達(dá)而達(dá)到促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用[16]。另外，發(fā)現(xiàn)敲除MALAT1能夠上調(diào)miR-140，削弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞的免疫屏障作用，由此可有效提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對藥物化療的免疫反應(yīng)性。近期研究還初步發(fā)現(xiàn),MALAT1還可通過抑制miR-155的表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞起作用，敲低MALAT1可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)因其強(qiáng)大的自我更新以及分化能力，常常導(dǎo)致極差的預(yù)后以及短期內(nèi)復(fù)發(fā)。lncRNA能夠調(diào)節(jié)GSCs：MALAT1可與miR-129結(jié)合，通過降低miR-129提高其靶基因SOX2的表達(dá)，調(diào)節(jié)GSCs的特性及膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形成、增殖和遷移[17]。在GSCs中呈高表達(dá)的核富集常染色體轉(zhuǎn)錄物 1(NEAT1)，則是通過miR-107-CDK6通路，激活miR-107使得周期蛋白依賴性激酶(CDK)失活。NEAT1在敲除后，細(xì)胞周期可停滯在G1期[18]。

從X染色體失活中心轉(zhuǎn)錄得來的Xist，其主要作用是調(diào)節(jié)X染色體的失活。Xist在惡性膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，并增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥替莫唑胺的耐藥性[19]。其可能機(jī)制是Xist作為miR-137的ceRNA，結(jié)合并抑制miR-137，促進(jìn)其靶基因Rac1的表達(dá)[20]。另外，研究證實(shí)敲除Xist可上調(diào)miR-152，達(dá)到抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的作用。

以上是一些經(jīng)典的lncRNA-miRNA在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制。另外經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：與膠質(zhì)瘤惡性程度正相關(guān)的lncRNA不僅促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生及其發(fā)展，并且與患者的不良愈后顯著相關(guān)，如：lncRNA-ATB通過抑制miR-200a進(jìn)而促進(jìn)TGR-β2的表達(dá)起作用；同源異形框轉(zhuǎn)錄反義基因間RNA(hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)作為miR-15b的ceRNA，通過HOTAIR-miR-15b-p53軸起作用，而miR-15b既可通過單獨(dú)抑制HOTAIR，又可通過促進(jìn)p53基因的表達(dá)起作用[21]。

而另一些lncRNA抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯低于正常大腦神經(jīng)組織：癌癥易感性候選基因2(CASC2)、牛磺酸調(diào)節(jié)基因(Taurine Up-Regulated 1，TUG1)、lncRNA Cas5和lncRNA RP5-833A20.1等。CASC通過抑制miR-21的表達(dá)起作用。TUG1是miR-R26a的分子海綿，miR-R26a通過結(jié)合PTEN的3’UTR啟動TUG1-miR-R26a-PTEN軸抑制膠質(zhì)瘤。但膠質(zhì)瘤細(xì)胞因?yàn)樾枰獱I養(yǎng)物質(zhì)，因此其血管生成受到調(diào)節(jié)，TUG1-miR-299通過調(diào)節(jié)VEGF促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管生成[22]。lncRNA Cas5通過抑制miR-222起作用。lncRNA RP5-833A20.1通過抑制NFIA的mRNA和蛋白水平以增強(qiáng)NFIA啟動子的甲基化，增加miR-382-5p的表達(dá)起作用。

5 小結(jié)與展望

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，復(fù)發(fā)和死亡率均很高。膠質(zhì)瘤患者5年平均生存率僅為20%，其最具生物侵襲性的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)，其患者的5年平均生存率<3%。即使進(jìn)行了積極的手術(shù)、放化療，GBM患者的預(yù)后仍然很差，診斷后的中位OS只有12～15個月。目前GBM發(fā)生和發(fā)展的基因及其分子學(xué)機(jī)制尚不完全清楚，因此，在基因和分子水平上掌握膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制至關(guān)重要。充分了解并深入分析lncRNA-miRNA在膠質(zhì)瘤早期發(fā)生及其發(fā)展過程中的作用機(jī)制有助于為膠質(zhì)瘤患者的早期診斷和治療提供確切可靠的科學(xué)依據(jù)。