糖尿病角膜上皮維持穩態的機制探究

李秋玉，彭佳欣，邵 毅

0 引言

2型糖尿病(T2DM)的特點是胰島素調節紊亂和血糖控制受損[1]。目前T2DM被認為是一種全球性的流行病，全球有超過4億人患有T2DM[2]。血糖自動調節功能的減弱會引發心血管疾病、腎病和神經病變等一系列嚴重的健康問題[3-4]。血糖失調容易使眼睛出現多種并發癥，人們研究最為深入的是糖尿病性視網膜病變。由于慢性高血糖導致視網膜缺血，促進脆弱血管的增生，從而最終導致視網膜損傷，增加視網膜脫離的風險。除了視網膜損傷，糖尿病患者還易患青光眼和白內障[5-6]。此外，干眼是與糖尿病患者相關的一種共病狀態，可進一步加重眼表損害[7]。

角膜上皮是天然免疫系統的第一道防線，保護眼睛免受微生物入侵。角膜上皮的獨特之處在于它是無血管的。因此，角膜上皮不直接從血液吸收葡萄糖，而是通過房水吸收葡萄糖。葡萄糖也存在于淚液中，但淚液中的葡萄糖水平遠低于房水和血清中的葡萄糖水平[8]。在糖尿病患者中，角膜上皮暴露在高水平的葡萄糖中。除了慢性高血糖外，角膜還會受到高度的炎癥和氧化應激的影響[9]。角膜并發癥是很常見的，存在于40%～70%的糖尿病患者中[4，10]。糖尿病性角膜病變的并發癥包括：從淺表性點狀角膜炎到復發性角膜糜爛和持續性上皮缺損。后者的特征是基底膜的喪失和基質潰瘍。在疾病控制不佳的情況下，角膜上皮的屏障功能會逐漸減弱，淺表性點狀角膜炎正是在角膜上皮的緊密屏障功能受到破壞時發生的。糖尿病患者由于基底神經叢感覺神經纖維密度降低，其角膜敏感度也降低[11]。角膜神經支配的喪失被認為是基底角膜上皮細胞被破壞和角膜上皮變薄的基礎。

角膜損傷后，需要高效和高度協調的傷口愈合機制以保持其透明和恢復屏障功能，位于邊緣基底層的干細胞可以提供必要的細胞來補充受損的上皮細胞[12]。上皮細胞修復初始的潛伏期以細胞脫落和基底層重組為特征。隨后的細胞遷移和增殖的線性愈合階段導致傷口閉合。基于分子水平的修復過程是復雜的，部分受生長因子、同源受體及其下游效應通路的調控。越來越多的證據表明，類似于糖尿病，細胞外富含葡萄糖的培養可以誘導細胞高血糖狀態，改變這些通路中的關鍵因子的表達。本篇綜述將總結目前對于高血糖對角膜上皮調節穩態和修復創傷的分子機制的影響的認識，并進一步討論這些機制中相關通路作為靶點用于治療和保護糖尿病患者角膜的潛力。

1 糖尿病性角膜上皮維持穩態的可能機制

1.1 EGFR介導ERK和PI3K/Akt的磷酸化表皮生長因子受體(EGFR)在維持上皮細胞的存活、增殖和分化方面有著廣泛的作用。EGFR通過與配體結合二聚后觸發自磷酸化和下游信號通路的啟動[13]。角膜上皮損傷后，表皮生長因子受體有明顯的代償性升高，其下游效應因子磷酸化，包括細胞外信號調節激酶(ERK)和磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/Akt，以促進傷口愈合[14]。

與體外研究一致，Yu等證明了1型糖尿病鏈脲佐菌素(STZ)大鼠角膜上皮中EGFR介導的PI3K/Akt磷酸化減少[15]。B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)相關死亡啟動子(BAD)是Akt下游的促凋亡蛋白，并在ERK和Akt磷酸化時失活。EGFR信號轉導的減少使BAD的活性增強，從而導致細胞增殖減少和傷口愈合明顯受損的促凋亡狀態。PI3K/Akt途徑也參與促進細胞遷移。在糖尿病大鼠角膜中，弱磷酸化Akt在基底上皮細胞中明顯存在。這一發現與報道的傷口愈合延遲一致[15]。

1.2 抑制IGBP-3的合成胰島素受體(INSR)和胰島素樣生長因子1型受體(IGF-1R)與細胞外配體IGF-1、IGF-2或胰島素結合，誘導其自磷酸化和銜接蛋白的募集以觸發下游信號級聯[16-17]。INSR和IGF-1R在體外培養的人角膜上皮細胞和原位培養的人角膜上皮細胞中均有表達[18]。由于其高度的結構相似性，INSR和IGF-1R已被報道形成雜交受體(hybrid-R)。在糖尿病組織中可觀察到hybrid-R的表達增加，其被認為在介導配體特異性和胰島素非敏感性方面起著關鍵作用[19]。已經確定角膜上皮細胞中存在hybrid-R，并且表明hybrid-R主要對IGF-1敏感，而對胰島素不敏感[18]。

有相關研究表明，胰島素樣生長因子結合蛋白-3(IGFBP-3)與IGF1和IGF-2能夠高親和力結合，從而阻斷IGF-1R的激活[20]。IGFBP-3作為血清中主要的IGF結合蛋白，其功能是延長IGF-1的半衰期。這在糖尿病患者中非常重要，與非糖尿病對照組相比，糖尿病患者淚液的IGFBP-3水平增加了近3倍[21]。

當端粒酶永生化人角膜上皮細胞(hTCEpi)在細胞外高水平葡萄糖存在下培養時，IGFBP-3的分泌也同樣增加。這表明，在同一細胞系中，急性和慢性暴露在高糖環境中都會改變IGF-1的含量。在角膜上皮中，IGF-1刺激Akt，并通過IGF-1R的激活促進細胞生長[18]。

用重組IGF-1和IGFBP-3治療hTCEpi，確定二者在人類糖尿病患者淚液中的比例，減緩了IGF-1R的磷酸化和活化，對糖尿病患者配體利用率降低導致IGF-1R信號轉導減少，有助于糖尿病角膜上皮病變這一觀點具有一定的支持作用[22]。

1.3 增加TGFβ的分泌轉化生長因子β(TGFβ)是一種介導多種細胞活動的細胞因子，TGFβ在多種成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞中均有表達，并參與角膜組織修復[23]。TGFβ家族中存在3種不同的TGFβ亞型，在角膜上皮中均發揮一定的作用[24]。角膜上皮對TGFβ的作用很敏感。正常人和大鼠角膜損傷后，角膜上皮TGFβ3表達上調。在STZ糖尿病大鼠模型中，不存在這種上調。使用結膜下注射的方式向非糖尿病大鼠角膜中注射siRNA寡核苷酸，敲除TGFβ3能顯著減弱上皮表面修復。此外，與未經治療的對照組相比，將TGFβ3注射到1型STZ小鼠模型和2型Goto-Kakizaki大鼠模型均能加速角膜上皮愈合[25]。

1.4 上調Serpine1的表達人纖溶酶原激活物抑制劑1(Serpine1)，具有高度創傷誘導性，是TGFβ信號傳導的已知靶點[26]。Serpine1主要作為組織和尿激酶纖溶酶原激活物(tPA和uPA)的抑制物發揮作用，并介導細胞粘附、遷移、血管生成和腫瘤轉移[27]。在人類未轉化的角膜上皮細胞中，Serpine1促進角膜上皮細胞遷移，并在達到融合時促進隨后的粘附[28]。如Sun等[29]所證明的，在創傷部位近端的小鼠角膜上皮中，Serpine1的表達顯著上調。然而，在STZ小鼠中，與TGFβ類似，高血糖抑制了這種傷口愈合誘導的上調。與此一致，注射抗Serpine1抗體也可延遲非糖尿病角膜上皮的傷口愈合，而外源性補充Serpine1可使受損的糖尿病角膜上皮的傷口愈合恢復到正常水平。

1.5 增加HGF的分泌肝細胞生長因子(HGF)和分散因子(SF)是能夠結合原癌性受體c-met，誘導多種類型組織的細胞遷移和增殖的配體，包括角膜上皮細胞。Kakazu等[30]證明HGF通過激活PI3K/Akt通路促進角膜上皮細胞存活。在角膜損傷的小鼠模型中，Omoto等[31]發現用HGF治療不僅能促進增殖，而且抑制炎癥。Saghizadeh等[32]使用一種器官培養模型來評估HGF在角膜上皮中的表達。在他們的報告中，糖尿病患者c-met的下調對c-met配體HGF的敏感性產生負面影響。因此，HGF表達的增加可能是糖尿病引起的c-met衰減時的一種嘗試性代償反應。

利用腺病毒轉導將c-met基因轉導至器官培養的糖尿病患者角膜中，進一步證實了c-met活化在糖尿病患者中的作用。在這項研究中，c-met的異位表達恢復了特定生長因子及其受體的組織學染色模式，并改善了角膜傷口愈合[32]。與糖尿病類似，特異性c-met抑制劑PHA 665752損害角膜傷口愈合，這是由于c-met可介導促增殖PI3K/Akt途徑的激活[32]。除了增殖，c-met還可誘導p38 MAPK磷酸化，這是角膜上皮細胞遷移所必需的[33]。這已在一個器官培養的糖尿病角膜模型中得到證實，表明c-met誘導的p38 MAPK磷酸化受損是糖尿病性角膜病變的關鍵途徑。

1.6 激活晚期糖基化終產物受體合成晚期糖基化終產物(AGEs)的積累也被認為會引發糖尿病并發癥[34]。與非糖尿病健康對照組相比，在糖尿病患者的淚液中檢測到晚期糖基化修飾蛋白含量的升高[35]。現有證據還表明，糖尿病患者角膜上皮以異常高的速率累積晚期糖基化終產物，這可能有助于糖尿病性角膜病變的發展[7,31]。

Shi等[36]利用人端粒酶永生化角膜緣上皮細胞系(HUCLs)，用經AGEs修飾的牛血清白蛋白(BSA)處理HUCL細胞。他們的發現表明，用AGE-BSA處理HUCL細胞可誘導凋亡，AGE-BSA上調了AGE受體(RAGE)的表達，并且加入阻斷RAGE的抗體抑制了活性氧(ROS)的產生和凋亡。

據報道，STZ誘導的糖尿病大鼠淚腺中存在高水平的AGEs[37]。淚腺中的AGEs升高與淚腺重量減輕和炎癥增加有關。據推測，AGEs可能通過使淚腺分泌淚液減少而導致角膜功能障礙。這會導致干眼癥，并進一步引發炎癥和損害角膜表面。

1.7 增強去乙酰化酶1的表達去乙酰化酶1(SIRT1)是一種Ⅲ類組蛋白/蛋白脫乙酰酶(HDAC)，調節基因表達和代謝[38]。SIRT1作為一種脫乙酰酶，通過p53的脫乙酰作用介導細胞存活。此外，它在葡萄糖代謝、胰島素分泌和胰島素敏感性方面也可能發揮一定的作用[39-40]。有關胰島素敏感性的證據來自于對人肝癌(HepG2)細胞和永生化成肌細胞系(C2C12)的研究，其中SIRT1下調與胰島素敏感性降低相關。同樣，在HepG2細胞中敲除SIRT1基因后胰島素敏感性減弱。與此相反，用已知的SIRT1激活劑白藜蘆醇進行治療，上調在C2C12肌管中的SIRT1，這使得胰島素抵抗培養模型和2型糖尿病高脂小鼠的胰島素敏感性恢復[41]。

在體外和體內模型中，當暴露于高糖水平時，角膜上皮中的SIRT1表達降低，從而減少傷口愈合。在人角膜上皮細胞系(THCE)中，創傷愈合能力通過腺病毒介導的SIRT1的過表達得以恢復[42]。這是通過降低p53的去乙酰化，降低IGFBP-3的表達，增加IGF-1R的表達和增加Akt的磷酸化來實現的。如前所述，IGFBP-3在糖尿病患者淚液中增加，而IGFBP-3與IGF-1在糖尿病患者淚液中的比例足以阻斷IGF-1與IGF-1R的結合。

細胞內IGFBP-3與p53乙酰化有關。因此，在角膜上皮中，SIRT1可能通過p53的乙酰化/去乙酰化和IGFBP-3含量的控制來調節IGF-1R/Akt信號通路。除了下游介質外，還研究了SIRT1的上游調節。Gao等[43]利用小鼠角膜緣/角膜上皮細胞系，報道了某些micro-RNAs(miRNAs)在抑制SIRT1中的作用，miR-204-5p是負責基因調控的較小的非編碼RNA分子。他們發現，與非糖尿病對照組相比，miR-204-5p在糖尿病模型中增加了5倍。使用miRNA拮抗劑敲除miR-204-5p可增強SIRT1的表達，并在高血糖狀態下恢復細胞周期進程。這使得角膜上皮傷口愈合的增加，與先前上調SIRT1的表達促進糖尿病性角膜上皮修復的研究相符合[42-43]。

1.8 神經激肽1與其配體P物質相互作用角膜神經支配的喪失對角膜上皮表面有顯著影響。有研究表明，角膜中的感覺神經元中存在神經激肽1受體(NK1R)，它是一種主要存在于神經系統中的G蛋白偶聯受體。P物質是一種屬于速激肽家族的神經肽，可以激活NK1R[44]。Yang等[45]首次報道在C57BL/6糖尿病小鼠局部應用P物質，可以促進角膜上皮創口愈合。他們利用TKE2小鼠角膜上皮細胞系，進一步證明，在高糖培養中P物質通過EGFR影響上皮細胞的遷移和增殖，從而激活Akt和SIRT1。NK1R拮抗劑L-733060的加入減弱了P物質的作用，表明NK1R可能是靶點。同樣，在正常小鼠中添加L-733060會減弱EGFR、Akt和SIRT1的激活，降低角膜敏感度，從而促進上皮傷口愈合。基于這些發現，作者得出結論，在角膜上皮中，NK1R是由角膜神經分泌的P物質所激活的[45]。而神經元本身具有重要功能，如介導反射和調節淚液分泌， P物質與NK1R的相互作用表明了角膜神經支配在維持角膜上皮完整性中的重要作用。

1.9 抑制基質金屬蛋白酶以保護基膜基底膜結構和成分以及細胞間粘附的改變是糖尿病性角膜病變的病理生物學基礎。Tabatabay等[46]的早期研究通過電子顯微鏡觀察糖尿病供體角膜組織，發現基底膜的改變和半橋粒數量減少，這可能是基底上皮細胞粘附力減弱的原因。同樣，高血糖培養的人角膜上皮細胞也顯示出信息水平的降低，表明暴露于高糖的角膜上皮細胞表現出基底膜分泌異常[47]。

基質金屬蛋白酶(MMP)是參與基底膜和細胞外基質降解主要的酶。Saghizadeh等[48]在器官培養模型中的研究表明，MMP-3和MMP-10以及組織蛋白酶F的表達和活性在糖尿病角膜上皮中上調。正常條件下在成人組織中MMPs的表達通常是低到不存在的[49]。糖尿病角膜中MMP的表達增加可能在一定程度上導致角膜上皮基底膜的破壞，異常高水平的MMPs也會損害上皮傷口的愈合。

2 總結與展望

角膜病變是糖尿病最常見的眼部并發癥，可能導致視力下降甚至喪失。在角膜上皮的創傷愈合過程中，增殖、遷移和分化是不可缺少的步驟。本篇綜述從細胞水平總結了角膜上皮調節這些關鍵穩態過程的許多潛在的分子途徑，通過EGFR介導ERK和PI3K/Akt的磷酸化，抑制IGBP-3的合成，增加TGFβ的分泌，增加HGF分泌，激活晚期糖基化終產物受體合成，上調Serpine1的表達，抑制基質金屬蛋白酶以保護基膜，這些因素中的任何一個都是可能的機制，但也可能包含多種因素的協同作用。隨著對角膜病變的研究越來越深入，各種作用機制的具體貢獻將得到進一步闡明。但對于充分了解高血糖、炎癥和氧化應激對糖尿病角膜上皮內穩態破壞是否具有重疊作用，我們仍有大量的工作需要做。