血-視網膜屏障損傷的機制及治療對策

李 敏，莫詩雯，李 伊，張全鵬,3

0 引言

血-視網膜屏障(blood-retina barrier，BRB)在維持視網膜微環境穩態中起重要作用，很多疾病如糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、急性青光眼、早產兒視網膜病變等都會出現BRB損傷[1]。導致BRB損傷的相關因素很多，如缺血缺氧、氧化應激與活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生、炎癥因子致炎作用以及強光持續刺激等，但是目前BRB損傷的機制仍不十分明確。盡管目前對BRB損傷的治療有藥物治療、手術和激光等多種療法，但尚沒有根治BRB損傷的有效方法。因此，深入探究BRB損傷的發病機制并有效阻斷BRB損傷的發生和發展，對伴有BRB損傷的相關眼病的診療具有重要的指導意義。

1 BRB的結構及功能

血眼屏障是血液與眼部的房水、晶狀體和玻璃體等組織之間存在的屏障。BRB是血眼屏障的一個重要組成部分，它在體循環與視網膜環境之間形成屏障，在維持正常視網膜功能中起著重要作用[2]。BRB可分為外血-視網膜屏障(outer blood-retina barrier，oBRB)和內血-視網膜屏障(inner blood-retina barrier，iBRB) 兩部分，其中oBRB由視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞及其連接構成，iBRB由視網膜血管內皮細胞及其連接、基底膜、周細胞和星形膠質細胞的突起共同構成[3]。

1.1 oBRBRPE位于感光視網膜和脈絡膜的Bruch膜之間，兼具吞噬細胞、上皮細胞、色素細胞這三種細胞的功能[4]。RPE在其鄰近感光細胞的代謝支持中起關鍵作用，并參與感光細胞外膜的生物更新[4]。另外RPE還能分泌抑制新生血管的色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)，使得PEDF與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)達到動態平衡，而阻止脈絡膜新生血管的發展[4-5]。RPE介導的BRB完整性缺失是糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)的一個重要特征，而DME是DR引起的一種慢性病變[4]。

1.2 iBRB視網膜血管內皮細胞是覆蓋在血管腔上的單層細胞，在血液循環和神經視網膜之間起著選擇性屏障的作用，同時有效地為神經視網膜提供氧氣和營養[6]。視網膜血管內皮細胞連接包括緊密連接(tight junctions，TJs)、黏附連接(adherens junctions，AJs)和縫隙連接(gap junctions，GJs)，三者共同形成復合體，調節細胞通透性和維持細胞極性，介導細胞間黏附和相互通訊[3]，維持視網膜局部微環境的穩定[6]。其中TJs是BRB最主要的連接結構，BRB正常功能的發揮主要依賴于血管內皮細胞間的TJs蛋白的完整性[3]。形成TJs復合體的蛋白包括多種蛋白如跨膜蛋白Claudins、Occludins、膜相關蛋白(如ZO-1、ZO-2、ZO-3)和TJs黏附因子等[7]。

此外，視網膜中的周細胞、星形膠質細胞、Müller細胞以及小膠質細胞對BRB發揮正常功能有著重要影響[6]。周細胞可調節視網膜毛細血管局部血流量及血管通透性，具有支持血管內皮細胞的作用，周細胞丟失會促進BRB破壞，增加血管通透性，導致血管源性黃斑水腫[8]。星形膠質細胞是存在于視網膜的神經膠質細胞，包裹著視網膜神經節細胞的軸突，形成軸突血管膠質鞘，這些細胞作為BRB的活躍部分，能夠感知神經元功能變化，控制從血管到神經元的物質轉移[6]。Müller細胞是視網膜中最豐富的膠質細胞，從視網膜下間隙延伸到玻璃體，是神經元與血管之間的解剖和功能連接支架，具有調節血管張力，維持BRB的完整性等重要作用[9]。小膠質細胞是負責維持大腦和視網膜內穩態的免疫細胞[10]，一般情況下，小膠質細胞不斷地監視視網膜實質，具有分泌神經營養因子，吞噬細胞碎片和功能失調或無用的突觸等作用[11]。

2 BRB損傷的機制

2.1 糖尿病視網膜病變DR為糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的微血管并發癥之一，是一種神經血管類疾病[12]。高血糖是引起糖尿病患者DR的主要原因。長期高血糖會導致糖尿病患者體內代謝紊亂以及全身微循環障礙，眼底視網膜血管容易受損，從而發生DR[13]。BRB的破壞是DR的特征性病理改變，表現為血流減少，白細胞淤滯，引起血管滲透性增加和病理性血管生成[12-14]。DR導致BRB損傷的主要環節包括：(1)高血糖會引起內皮細胞黏附蛋白的表達上調，促進白細胞和單核細胞停滯，引起血管障礙，凝血系統亢進，纖溶功能低下，視網膜毛細血管阻塞，從而可能導致血管內皮細胞功能障礙及死亡[15]；另有體外研究表明，高血糖會導致視網膜內皮細胞數量顯著減少，引起血管生成和小動脈瘤的發生[16]。(2)促進線粒體ROS產生增加，并發生氧化應激損傷線粒體DNA，加速細胞凋亡[6]；ROS增加會導致炎癥介質的產生和多種代謝途徑的激活，如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途徑、晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)途徑、己糖胺途徑和多元醇途徑[6]，而PKC激活、氧化應激增強及AGEs增多等會破壞BRB結構和功能[17]。糖尿病患者視網膜ROS增加，抗氧化防御系統會受到損害，同時會刺激促炎因子的釋放，導致慢性炎癥的發生[6]。(3)造成視網膜缺血缺氧，導致視網膜內皮細胞損傷、微血管通透性增加以及炎癥部位炎癥細胞的聚集，促進DR的發生[6]。(4)視網膜炎癥對DR的發生發展起重要作用[18]。DR時，機體內的炎癥介質和細胞因子等物質可以在轉錄、翻譯、翻譯后修飾水平等不同階段改變連接蛋白的結構并引起其功能障礙，也可直接損傷血管內皮細胞、周細胞和RPE細胞，最終引起細胞間隙增大，連接結構破壞，BRB通透性增加[18]，也可誘導RPE細胞異常分泌VEGF，從而導致內皮細胞損傷、BRB破壞和新生血管的生成[19-21]。VEGF是造成DR發生的促新生血管因子，也是一種促炎因子，它在調節視網膜新生血管生成方面具有關鍵作用[22-23]。VEGF可以降低緊密連接蛋白Occludin的表達[24]，且在高糖環境下Occludin蛋白的表達隨著視網膜血管內皮細胞VEGF表達增加而下調[25]。在視網膜Müller細胞中，糖尿病可誘導啟動IL-17RA/Act1/NF-κB信號系統和產生白介素(IL)-17A，Act1信號系統的激活和IL-17A的分泌是炎性反應的標志[12]。研究表明，外源性IL-17A可導致糖尿病誘導的Müller細胞的功能惡化和活動不良、BRB崩解和視網膜神經元的凋亡[12]，這加速了DR的進展。核轉錄因子(NF-κB)負責誘導各種常見的促炎細胞因子如IL-1p、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的產生，它們在糖尿病患者或大鼠的玻璃體、視網膜及血清中的含量明顯增加；TNF-α是視網膜血管系統中白細胞淤滯的有效介質之一，它的增加引起細胞間黏附分子-1(ICAM-1)上調以及緊密連接蛋白Occludin減少；而TNF-α和ICAM-1兩者共同促進血管內皮細胞和周細胞的凋亡，最終導致BRB完整性的破壞[26]。(5)甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)是體內糖酵解產生的一種細胞毒性代謝物。研究發現DR患者MGO水平升高，而MGO的升高會激活基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)以及AGEs前體的表達，從而導致TJs蛋白表達減少，BRB通透性增加[27]。

因此，DR導致BRB損傷的機制為多因素、多環節共同作用的結果。高血糖導致缺血缺氧、氧化應激ROS產生增多、促炎因子或炎癥介質的釋放等環節介導視網膜內皮細胞損傷和TJs蛋白表達減少，是目前比較認同的DR中BRB破壞的機制，其中VEGF介導TJs蛋白改變在DR中BRB破壞的機制研究較多、較透徹。

2.2 急性青光眼急性高眼壓動物模型是常用的急性青光眼動物模型，屬于缺血缺氧實驗動物模型[28]。視網膜缺血缺氧時，作為對缺氧敏感的核轉錄因子缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)會被激活[29]。在實驗性青光眼中，眼壓升高會引起HIF-1α及其靶基因表達上調[30]。研究發現，急性高眼壓后HIF-1α的表達在早期明顯上調，晚期逐漸恢復，其表達的時空特征與BRB損傷的時空特征一致，提示急性高眼壓后HIF-1α的表達上調可能與BRB的損傷有關[31]。而誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、視網膜葡萄糖轉運因子-1(glucose transporter-1，GLUT-1)和VEGF都是HIF-1α的下游分子[30]，可能在BRB損傷中起重要作用。研究表明，急性高眼壓后iNOS的表達增加，分析可能是由于神經膠質細胞激活和NOS上調而導致視網膜和視神經損傷[32]。GLUT-1是葡萄糖通過BRB的唯一載體，急性高眼壓后早期大鼠視網膜GLUT-1表達下調，嚴重影響了血液中的葡萄糖轉運至視網膜細胞，視網膜神經細胞由于葡萄糖的缺乏而出現代謝紊亂，進而導致視網膜損傷[33]。VEGF是在生理和病理情況下血管生成過程中增加微血管通透性的主要因子[34]。VEGF-A是一種有效的血管生成因子，可誘導內皮細胞遷移、增殖、分化和再生[35]。VEGF-A是由8個外顯子的選擇性剪接產生的，由外顯子8(外顯子8a)近端剪接形成的促血管生成VEGF-Axxx和外顯子8(外顯子8b)遠端剪切產生的抗血管生成VEGF-Axxxb。VEGF-A 165b可保護視網膜免受缺血損傷[36]。在實驗性青光眼模型中，眼壓升高可誘導VEGF表達上調的只是其中一個亞型VEGF-A 165b，其可以抑制血管生成，而另一個亞型VEGF-A 164可促進血管生成，表達水平并沒有改變[37]。因此，VEGF在急性高眼壓引起的BRB損傷中的作用尚存爭議。而HIF-1α及其下游分子iNOS、GLUT-1和VEGF在急性高眼壓引起的BRB損傷中的具體作用環節和作用機制仍不完全清楚，需進一步研究確定。

2.3 早產兒視網膜病變早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是一種發生于低出生體質量早產兒的視網膜血管異常增殖的嚴重致盲眼病[38]。目前有多種關于ROP的致病學說，包括VEGF、HIF-1、胰島素樣生長因子、促紅細胞生成素(EPO)、一氧化氮氧化物、胎盤生長因子、腺苷、Apelin以及β-腎上腺素能受體(β-adrenergic receptors，β-ARs)的多效性和交感神經系統的作用[39]。用于研究ROP發病機制的動物模型常見的有氧誘導的視網膜病動物模型[40-42]，研究發現在氧誘導的視網膜病變中，常出現視網膜新生血管形成和BRB破壞，Caveolin-1[40]、Netrin-1[41]和VEGF[42]在其發病過程中起關鍵作用。其他如HIF-1、胰島素樣生長因子、一氧化氮氧化物、胎盤生長因子、腺苷等分子在氧誘導的視網膜病變BRB破壞過程中的具體作用機制尚需進一步研究。

2.4 其他視網膜經強光長時間照射后易引起光感受器層的光損傷，光感受器損傷的主要機制包括自由基和脂質過氧化物介導的氧化應激、凋亡相關因子的調節、細胞內鈣水平升高和視紫紅質介導的損傷[43]。光損傷會導致RPE的通透性增加，可能與VEGF信號途徑有關。光損傷也會啟動細胞凋亡程序，導致光感受器細胞進行性凋亡，外節膜盤不斷脫落，RPE不斷被吞噬，在超出其負荷時即出現視網膜色素細胞凋亡，繼而引起iBRB和oBRB破壞[44-45]。

3 BRB損傷的治療

3.1 藥物治療

3.1.1 抗VEGF藥物目前常見的抗VEGF藥物有貝伐單抗(Bevacizumab，商品名Avastin)、雷珠單抗(Ranibizumab，商品名Lucentis)、阿柏西普(Aflibercept，商品名VEGF Trap-Eye)，它們可與VEGF-A所有亞型結合并抑制其表達[13]。貝伐單抗和雷珠單抗均是VEGF特異性抗體，前者為重組人源化的全長單克隆IgG抗體，后者為單克隆抗VEGF抗體片段重組體。雷珠單抗較貝伐單抗有更好的視網膜穿透力和作用，但價格更高。阿柏西普是VEGF受體重組融合蛋白，與VEGF結合的親和力是雷珠單抗的140倍[46]。但有研究報道部分增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)患者玻璃體中VEGF水平不升高，在這些非VEGF應答者中，由于促炎細胞因子發揮了主要的病理作用，因此玻璃體腔內注射類固醇更為合適[47]。另外，有研究表明玻璃體腔內注射KH902(VEGF受體抑制劑)能夠抑制糖尿病大鼠視網膜內皮細胞Occludin和Claudin-5水平下調，保護糖尿病大鼠iBRB的功能[48]。

3.1.2 皮質類固醇皮質類固醇通過多種機制產生抗炎作用[49]，包括炎癥介質、VEGF合成減少。糖皮質激素玻璃體內治療可抑制大鼠視網膜ICAM-1的表達，顯著降低炎癥反應，改善BRB功能[50]。研究認為，皮質類固醇在治療DME中的應用可能比抗VEGF治療更有效[51]。目前，可用于玻璃體腔內注射的皮質類固醇藥物包括曲安奈德、地塞米松(Ozurdex)和氟辛諾酮(Iluvien)[47]。

3.1.3 促進緊密連接蛋白表達的潛在藥物研究發現，七葉皂苷鈉可能通過促進Occludin蛋白表達抑制ROCK信號通路，降低視網膜血管內皮細胞的通透性，穩定BRB功能，阻止DR的發生發展，具有改善大鼠DR的藥效活性[14]。體外實驗證明，多重激酶抑制劑阿西替尼(axitinib)可通過抑制低氧條件下內皮細胞Occludin及ZO-1的下調，從而緩解低氧誘導的人臍靜脈內皮細胞滲漏性增加[52]。p38 MAPK信號通路激活可引起iBRB的滲漏及緊密連接蛋白的破壞，而核心蛋白多糖(decorin，DCN)可通過抑制p38 MAPK信號通路的激活實現對iBRB的保護作用[53]。人臍帶間充質干細胞可以通過抑制NF-κB信號通路抑制TNF-α、ICAM-1及VEGF的表達，進而使Occludin蛋白表達增加，這對維持BRB的正常功能及在早期DR引起的血管病變中具有重要作用[54]。

3.1.4 其他Connexin 43可能通過依賴ATP釋放/炎性小體通路激活的方式介導DME中發生的BRB破壞，抑制Connexin 43可使DME中的RPE免遭破壞，因此，Connexin 43是治療DME的潛在治療靶點[55]。Apelin-13可通過抑制小膠質細胞的活化和增殖、減少炎癥介質的釋放對氧誘導的視網膜病變模型鼠的BRB產生一定的保護作用[39]。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)能顯著減少ROS的生成，還可明顯改善光感受器細胞由于光暴露所引起的損傷，這可能是由于LBP預處理可上調氧化基因Nrf2和TrxR1，清除氧自由基，進而減少線粒體對氧化應激的反應，增強抗氧化能力，從而有效保護光感受器細胞誘導的視網膜損傷[43]。

3.2 激光治療激光的作用機制主要是破壞缺血視網膜，改善鄰近視網膜區域的氧合，減少VEGF的產生，同時促進視網膜色素上皮細胞和Müller細胞釋放細胞因子[47]。激光治療DR是一種高度有效的眼內治療手段，能預防糖尿病患者視力下降。激光治療雖然本身具有破壞性，但在預防視力喪失和長期保持視力方面效果顯著[56]。

3.3 手術治療玻璃體切割術(pars plana vitrectomy，PPV)是近年發展較快的高新技術，現已逐漸由傳統手術方式向微創甚至無創發展，常見的有23G、25G+ PPV術兩種，是眼科治療的突破。通過切除玻璃體可以祛除出血、清除病原微生物、取出眼內異物，為視網膜復位創造條件[57]。

4 小結與展望

HIF-1α及其下游分子在急性高眼壓引起的BRB損傷中的具體作用機制仍不完全清楚，是目前學者比較感興趣的研究方向。HIF-1、胰島素樣生長因子、一氧化氮氧化物、胎盤生長因子、腺苷等在氧誘導的視網膜病變BRB破壞過程中的具體作用機制目前尚不清楚，探討上述分子在BRB損傷中的具體作用機制，并找出合適的抑制BRB損傷的藥物，對于伴有BRB損傷的眼部疾病如急性青光眼、ROP的精準治療具有較好的前景。目前關于BRB損傷有關的眼部疾病的治療方法，由于VEGF在DR的BRB損傷中研究報道較多，作用機制研究較透徹，因此抗VEGF藥物應用較廣泛。對于病情較輕的患者一般采用其中一種或兩種治療方法即可，而對于病情較重的患者，抗VEGF藥物與全視網膜光凝術(panretinal photocoagulation，PRP)以及PPV的聯合治療較單一治療手段有更大的優勢[58-59]。關于聯合治療具體的治療時間順序[59]相關報道較少，還需要進一步研究調節和優化找出最佳治療順序。另外，皮質類固醇、提升緊密連接蛋白表達的潛在藥物等聯合PRP或PPV治療對BRB損傷相關的眼部疾病是否效果更好也值得去探究。