石斛與粉葛體外體內降糖降脂協同作用研究

許子楊 敬思群 林映君 丁佳敏 周 揚 于白音

(1. 韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東 韶關 512005；2. 韶關學院英東生命科學學院，廣東 韶關 512005)

醫學營養療法是糖尿病管理的一個重要組成部分[1]，而通過添加藥食同源的中藥營養的中藥營養治療已成為研究熱點并在動物試驗獲得理想療效[2-3]。鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)具有很高的藥用價值[4]，其主要功能性成分包括石斛多糖、石斛堿、氨基酸、多肽類、酚類化合物和部分金屬元素[5-6]，在所有活性成分中多糖含量是最高的(18%～30%)。多項研究表明，石斛具有降血糖[7-9]、降血脂[10-11]、抗腫瘤[12]、抗氧化[13-14]、提高免疫力[15]等作用。粉葛(PuerariathomsoniiBenth)為豆科多年生藤本植物，藥用價值高，可促進人腦的血液循環、增強記憶、降低血脂血糖、減肥健美[16]，研究表明粉葛中的化學成分含有異黃酮、三萜類、淀粉及礦物元素等[17-19]，其中粉葛總黃酮具有改善2型糖尿病病人胰島素抵抗的作用[20]?；鹕椒鄹鹗侵袊鴩业乩順酥井a品，丹霞鐵皮石斛是中國鐵皮石斛中的名貴優質品種，僅分布于粵北丹霞地貌巖石上，韶關石斛產業逐步成為粵北地區的特色產業。

咀嚼片是一種服用方便、療效顯著的制劑形式，經咀嚼后崩解時間大大節省，溶解度高，生物利用度也較高。但關于將石斛和粉葛復合研制咀嚼片尚未見報道，也未見關于石斛、粉葛及其食品的系統的體外體內協同降糖降脂作用研究。有報道[21]表明，石斛、葛根配伍無“十九畏”和“十八反”等配伍禁忌。

試驗擬在前人[22-24]研究的基礎上建立高糖、高脂果蠅模型，以海藻糖、甘油三酯、總蛋白含量為考察指標，評價石斛與粉葛體內的降糖降脂作用協同作用，為進一步的機制研究提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

石斛粉葛咀嚼片：實驗室自制[25]；

α-葡萄糖苷酶(來源于黑曲霉)： S10050-1ku， 活力≥50 Units/mg Protein，上海源葉生物科技有限公司；

對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)：含量>98%，上海寶曼生物科技有限公司；

阿卡波糖：拜耳醫藥保健有限公司；

鹽酸二甲雙胍片：齊魯制藥有限公司；

甘油三酯測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

總蛋白定量測試盒：武漢博士德生物工程有限公司；

海藻糖測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；

蔗糖、瓊脂、玉米粉、酵母粉、蔗糖和棕櫚酸等：市售；

黑檀體果蠅：中山大學細胞生物學與遺傳實驗室；

普通培養基配方：蒸餾水1 L，酵母25.000 g，玉米粉67.050 g，大豆粉9.180 g，瓊脂粉6.000 g，蔗糖40.000 g，麥芽糖42.400 g，對羥基苯甲酸甲酯0.25 mL，無水乙醇2.50 mL，丙酸6.875 g；

高糖培養基配方：普通培養基添加20%的蔗糖；

高脂培養基配方：普通培養基添加20%的棕櫚烯酸。

1.1.2 儀器設備

全波長多功能酶標分析儀：SHE-3000G型，北京塞爾福知心科技有限公司；

智能光照培養箱：GZ-250-GII型，韶關廣智科技設備有限公司；

臺式高速冷凍離心機：H1650R型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；

雙人單面凈化工作：SW CJ-2G型，蘇州博萊爾凈化設備有限公司；

體視顯微鏡：PXS-210型，梧州奧卡光學儀器有限公司。

1.2 樣品制備

1.2.1 石斛粉葛咀嚼片 以丹霞鐵皮石斛、火山粉葛為原料，以玉米淀粉、菊粉、甘露醇、木糖醇為輔料，經配料、制軟材、濕法造粒、干燥、整粒、壓片、包裝等工序制作而成。最佳工藝配方為[25]：原料中石斛∶粉葛為1∶4，原輔料比[(石斛+粉葛)∶輔料(玉米淀粉+菊粉+木糖醇+甘露醇)]為2∶3，輔料配比(玉米淀粉∶菊粉∶木糖醇∶甘露醇)為4∶3∶1∶1，潤濕劑60%乙醇的添加量為0.4 mL/g，硬脂酸鎂1.5%。

1.2.2 醇提液的制備 將咀嚼片粉碎，過40目篩，稱量10 g樣品按粉液比1∶20 (g/mL)，用70%乙醇在90 ℃條件下回流提取3 h。將提取液抽濾，分別旋蒸至溶液體積<100 mL，使用乙醇定容至100 mL容量瓶中，即得0.1 g/mL 咀嚼片醇提液，備用。

1.2.3 水提液的制備 稱量10 g樣品按粉液比1∶10 (g/mL)，用蒸餾水回流提取3 h。將提取液抽濾，分別旋蒸至溶液體積<100 mL，用蒸餾水定容至100 mL 容量瓶中，即得0.1 g/mL咀嚼片水提液，備用。

1.2.4 阿卡波糖溶液的制備 準確稱取5 g阿卡波糖，放入燒杯中用蒸餾水溶解，定容于50 mL容量瓶備用。

1.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

以阿卡波糖為對照。參照蔣鶯[26]的方法(PNPG法)進行。將反應液置于酶標儀405 nm下測定吸光度，每個樣品同時做3個平行試驗。酶活性抑制率按式(1)計算：

(1)

式中：

R——酶活性抑制率，%；

A空白——不加待測樣品反應后的吸收值；

A樣品——加入待測樣品反應后的吸收值；

A背景——只加待測樣品的吸收值。

1.4 果蠅降糖降脂試驗

參照段寅慧[27]的方法進行。果蠅分為正常對照組、模型組、陽性對照組和給藥組，以鹽酸二甲雙胍為陽性對照。給藥組又分為石斛組、粉葛組、石斛粉葛組。各組配方見表1。

將培養3 d的雄性果蠅隨機分組，正常對照組喂養普通培養基，隨機挑選出的果蠅2型糖尿病模型喂養高糖培養基、高脂培養基7 d后，再隨機分為模型組和咀嚼片給藥組，給藥組是指在培養基中分別加入石斛粉葛咀嚼片、粉葛咀嚼片、石斛咀嚼片，7 d后測定蛋白質、甘油三酯和海藻糖指標。果蠅模型試驗分組詳見表2。

表1 咀嚼片配方Table 1 Formula of chewable tablet

表2 果蠅模型試驗分組Table 2 High glucose drosophila model experiment grouping

海藻糖、甘油三酯、總蛋白含量：按試劑盒方法進行測定。

1.5 數據統計與處理

試驗數據以“X±S”表示，統計軟件SPSS 22.0用于分析差異的意義，P<0.05，顯著性差異；P<0.01，極顯著性差異，每個試驗做3個平行。

2 結果與分析

2.1 石斛粉葛咀嚼片對α-葡萄糖苷酶抑制能力

從圖1可知，各組對α-葡萄糖苷酶抑制作用都呈劑量—效應關系。石斛咀嚼片水提液、粉葛咀嚼片水提液、石斛粉葛咀嚼片水提液與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性強弱順序為：阿卡波糖>石斛咀嚼片水提液>石斛粉葛咀嚼片水提液>粉葛咀嚼片水提液；石斛咀嚼片醇提液、粉葛咀嚼片醇提液、石斛粉葛咀嚼片醇提液對α-葡萄糖苷酶抑制活性強弱順序為：阿卡波糖>粉葛咀嚼片>石斛粉葛咀嚼片醇提液>石斛咀嚼片醇提液。各組對α-葡萄糖苷酶抑制能力都呈劑量—效應關系。當濃度為5 mg/mL時，石斛粉葛咀嚼片水提液抑制率為28.55%，醇提液抑制率為21.60%，水提液的抑制能力略強于醇提液。綜上，石斛粉葛咀嚼片有一定的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，但弱于阿卡波糖。

多糖是鐵皮石斛最主要的化學成分，水溶性好[28]，粉葛中主要化學成分為葛根素、大豆苷元等異黃酮類化合物[29]，因此各組咀嚼片的水提液以石斛咀嚼片對α-葡萄糖苷酶抑制作用最強，而鐵皮石斛乙醇提取物中成分眾多，主要含有菲類化合物、聯芐類、茐酮類、酚酸類、黃酮、生物堿、揮發油、微量元素等[30]，各組咀嚼片的醇提液以粉葛咀嚼片作用最強，可能是火山粉葛的醇溶性總黃酮含量高所致，有待進一步試驗研究。

圖1 α-葡萄糖苷酶抑制活性Figure 1 Effect of concentration of sample on inhibitory activity of α-glucosidase

協同作用分析：水提液對α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值由小到大的順序為：石斛咀嚼片水提液<石斛粉葛咀嚼片水提液<粉葛咀嚼片水提液，以石斛咀嚼片作用最強，其次是石斛粉葛咀嚼片，粉葛咀嚼片抑制作用最弱；而醇提液對α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值由小到大的順序為：粉葛咀嚼片醇提液<石斛粉葛咀嚼片醇提液<石斛咀嚼片醇提液，以粉葛咀嚼片作用最強，其次是石斛粉葛咀嚼片，石斛咀嚼片抑制作用最弱。因此，石斛與粉葛對α-葡萄糖苷酶抑制活性無顯著的協同作用。

2.2 石斛粉葛咀嚼片對高糖誘導的果蠅2型糖尿病模型糖脂代謝的影響

由表3可知，高糖模型組與正常組相比，總蛋白含量有所降低，但無顯著差別，無統計學意義(P>0.05)；甘油三酯含量升高極顯著，有顯著統計學意義(P<0.01)；海藻糖含量升高極明顯，有明顯統計學意義(P<0.01)。模型建立。給藥后，(石斛+粉葛)咀嚼片組與高糖模型組相比，總蛋白含量無顯著差別，無統計學意義(P>0.05)；甘油三酯含量和海藻糖含量均極明顯降低，有明顯統計學意義(P<0.01)。因此，石斛粉葛咀嚼片有一定的降血糖作用。

2.3 石斛粉葛咀嚼片對高脂誘導的果蠅2型糖尿病模型糖脂代謝的影響

由表4可知，高脂模型組與正常組相比，總蛋白含量有所降低，但無顯著差別，無統計學意義(P>0.05)；甘油三酯含量升高極顯著，有顯著統計學意義(P<0.01)；海藻糖含量升高極顯著，有顯著統計學意義(P<0.01)，模型建立。給藥后，(石斛+粉葛)組與高脂模型組相比，總蛋白含量有所升高，但無顯著差別，無統計學意義(P>0.05)；甘油三酯含量降低極顯著，有顯著性差異(P<0.01)；海藻糖含量降低顯著，有統計學意義(P<0.05)。因此，石斛粉葛咀嚼片有一定的降血脂作用。這源于鐵皮石斛、粉葛異黃酮化合物及葛根素都有降血糖、降血脂的作用[31-33]。

表3高糖模型組果蠅的總蛋白質含量、甘油三酯含量、海藻糖含量?
Table 3 The total protein content,triglyceride content and trehalose content of hyperglycemia model group

組別總蛋白含量/(mg·mL-1)甘油三酯含量/(μg·mg-1)海藻糖含量/(mg·mL-1)正常組 3.62±0.210.28±0.022.44±0.03高糖模型組3.51±0.090.83±0.05??5.81±0.16??陽性對照組3.58±0.050.32±0.04##3.21±0.09##咀嚼片組 3.51±0.060.35±0.02##3.59±0.03##

? “*”表示與空白組比較P<0.05，“**”表示與空白組比較P<0.01；“#”表示與模型組比較P<0.05，“##”表示與模型組比較P<0.01。

2.4 石斛、粉葛協同降糖降脂作用

由表5可知：高糖組、高脂組中，皆以(石斛+粉葛)組降脂作用最強，其次是石斛組，最弱的是粉葛組，石斛與粉葛合用效果都優于各自單獨使用效果，因此石斛與粉葛有體內協同降糖降脂作用。

體內試驗表明，石斛和粉葛具有協同輔助降糖降血脂作用。石斛與粉葛在體外降糖試驗中未顯示協同降糖作用，但在體內試驗中卻顯示有協同作用。

表4高脂模型組總蛋白質含量、甘油三酯含量、海藻糖含量?
Table 4 Total protein content,triglyceride content and trehalose content of high-fat model group

組別總蛋白含量/(mg·mL-1)甘油三酯含量/(μg·mg-1)海藻糖含量/(mg·mL-1)正常組 3.62±0.210.28±0.022.44±0.03高脂模型組3.50±0.061.57±0.09??4.12±0.13??陽性對照組3.60±0.020.44±0.11##2.85±0.10##咀嚼片組 3.93±0.040.59±0.03##3.56±0.01#

? “*”表示與空白組比較P<0.05，“**”表示與空白組比較P<0.01；“#”表示與模型組比較P<0.05，“##”表示與模型組比較P<0.01。

表5 石斛和粉葛協同降糖降脂作用分析(給藥7 d后)Table 5 Analysis of hypoglycemic and lipid-lowering synergistic effects between Dendrobium and Pueraria thomsonii after 7 d medication

3 結論

各組咀嚼片的水提液、醇提液對α-葡萄糖苷酶抑制作用皆呈劑量效應關系。咀嚼片水提液以石斛咀嚼片作用最強，咀嚼片醇提液以粉葛咀嚼片抑制作用強，而水提液的抑制作用略強于醇提液，多糖是石斛的主要有效成分，醇溶性總黃酮是粉葛的主要有效成分，可以推測石斛體外降糖活性要強于火山粉葛；石斛組、粉葛組和(石斛+粉葛)組對高糖高脂誘導的果蠅模型的甘油三酯含量及海藻糖含量均有降低作用，但對蛋白質含量無顯著影響，其中以(石斛+粉葛)組作用效果最佳，說明石斛和粉葛具有體內協同降糖降脂作用。

試驗發現石斛和粉葛體外降糖作用與體內降糖作用不一致，與尹紅力等[34]關于黑木耳多糖報道不一致，除了原料不同以外，更重要的是體內代謝通路可能存在一些調節因子在起作用，因此關于石斛和粉葛協同降糖降脂機制還有待進一步的研究。