光核桃仁油和蛋白質同步提取工藝優化及油脂品質分析

闞金濤 袁 雷 鐘政昌

(西藏農牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000)

光核桃是西藏林芝地區資源最豐富的野果之一，果實肉厚味美，具有良好加工特性。光核桃果仁是果肉加工的下腳料，目前尚未被有效利用。據測定，光核桃仁含油量高(40.5%～51.4%)且以油酸和亞油酸為主，并富含VE等活性物質[1]，是一種優質的食用油，也可作為化妝品基油、高級潤滑油等；光核桃仁蛋白質含量約為23%～27%，其經適度水解后可獲得高抗氧化活性的多肽[2]，是一種優良蛋白質資源。

目前，植物油的工業化制油方法主要有壓榨法和有機溶劑浸出法，但壓榨法操作溫度較高餅粕蛋白變性較為嚴重，有機溶劑浸出法存在溶劑殘留等問題。水媒法是近年來制油技術中的研究熱點，包括水酶法與水劑法等，傳統的水酶法是在反應階段加入1%以上的蛋白酶，可大幅度提高油脂的提取率[3]，但酶解可能將蛋白質分解成一些品質不良的肽類并增加破乳難度[4]。水劑法具有加工條件溫和，可回收品質較好的蛋白質和肽類[5]，但在制油過程中存在嚴重的乳化現象，產品得率低[6]。破乳是水劑法提高產量的重要手段，有學者[7-8]采用鹽輔助、糖基輔助、乙醇輔助、超聲波輔助、微波輔助、冷凍解凍等方法法破乳，均不同程度地提高了油脂得率，但增加了蛋白質分離難度或導致蛋白質變性。

油脂和蛋白質同步提取是針對某些油料的蛋白質具有重要利用價值而開發的方法，目前處理研究階段，一般采用水劑法，油脂得率低[9-10]，而在水劑法基礎上提高產品得率的研究較少。李鵬飛[11]用水劑法同時提取花生的油脂與蛋白質后，再對乳狀液進行酶法破乳處理，其稱之為新型水酶法，此法大幅度提高了花生油與蛋白質的得率，而且加酶量少，蛋白質變性程度低，極具工業化應用的前景。新型水酶法提取條件復雜，不同油料的提取工藝條件各不相同。

試驗擬采用新型水酶法從光核桃仁中同步提取優質油脂和蛋白質。研究物料粒徑、液料比、pH值、溫度、時間等因素對油脂和蛋白質提取率的影響，優化光核桃仁油和蛋白質同步提取工藝條件，并分析核桃仁油的主要理化指標及脂肪酸組成，為光核桃仁深加工提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

光核桃果實：產自西藏林芝市巴宜區；

堿性蛋白酶：2.0×106U/g，邢臺思倍特生物科技有限公司；

其他試劑均為分析純；

離心機：LD5-10型，湘儀離心機儀器有限公司；

膠體磨：JMF/B-80型，上?？苿跈C械設備有限公司；

冷凍干燥機：TF-FD-1型，上海拓紛制冷設備有限公司；

氣相色譜儀：7890A型，美國安捷倫科技有限公司；

油脂氧化穩定性測定儀：OSI-24型，美國Omnion公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 光核桃仁油和蛋白質同步提取工藝

1.2.2 操作要點

(1) 磨漿及粒徑控制：稱量出一定量的去皮桃仁，按液料比2∶1 (mL/g)加入去離子水，用膠體磨進行磨漿，在設定粒徑(如80目)下回流5處理次，即視為得到該粒徑(80目)的漿料，分別制備80，120，150，200，250，300目6種粒徑的物料，備用。

(2) 加水調漿：取一定量的漿料，按設定的液料比加入60 ℃去離子水，用1 g/100 mL的NaOH調節初始pH(6～11)，在水浴中恒溫(40～90 ℃)攪拌20～30 min，再次調節體系至初始pH，并繼續水浴恒溫攪拌2～5 h。

(3) 四相分離：將料液低速(3 600 r/min)離心20 min，得油脂(最上層)、乳狀液(第2層)、可溶蛋白水相(第3層)和渣。收集游離油I，將余下的二相液體移入分液漏斗中分離出蛋白液和乳狀液，棄去渣餅。

(4) 分離游離油II：將乳狀液Ⅰ高速(8 000 r/min)離心15 min，得到游離油II和乳狀液II。

(5) 破乳：取適量的乳狀液II于100 mL試管中，堿性蛋白酶按乳狀液總重量添加1 200 U/g，在55 ℃、pH 9.5 的條件下酶解60 min，8 000 r/min離心20 min[12]，上層游離油即為破乳油。

(6) 收集蛋白質：蛋白液用1 mol/L鹽酸調至等電點(pH 4.7)，8 000 r/min離心25 min，棄去上清液，將蛋白沉淀加入少量水分，調節pH值至7.0，冷凍干燥(真空度65 Pa，溫度-55 ℃，時間38 h)后得光核桃仁蛋白。

1.2.3 光核桃果仁油和蛋白質同時提取工藝的優化

(1) 物料粒徑的選擇：在液料比8∶1 (mL/g)、浸提溫度60 ℃、提取時間4 h、浸提pH 10、攪拌速度80 r/min的條件進行試驗，考察物料粒徑(80，120，150，200，250，300目)對核桃仁油和蛋白提取率的影響。

(2) 液料比的選擇：在物料粒徑200目、浸提溫度60 ℃、提取時間4 h、浸提pH 10、攪拌速度80 r/min的條件下進行試驗，考察液料比[2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1 (mL/g)]對核桃仁油和蛋白提取率的影響。

(3) pH的選擇：在物料粒徑200目、液料比 8∶1 (mL/g)、浸提溫度60 ℃、提取時間4 h、攪拌速度80 r/min 的條件下進行試驗，考察pH(6，7，8，9，10，11)對核桃仁油和蛋白提取率的影響。

(4) 浸提溫度的選擇：在物料粒徑200目、液料比8∶1 (mL/g)、提取時間4 h、浸提pH 10、攪拌速度80 r/min 的條件下進行試驗，考察浸提溫度(20，30，40，50，60，70 ℃)對核桃仁油和蛋白提取率的影響。

(5) 浸提時間的選擇：在物料粒徑200目、液料比8∶1 (mL/g)、浸提溫度60 ℃、浸提pH 10、攪拌速度80 r/min 的條件下進行試驗，考察浸提時間(1，2，3，4，5，6 h)對核桃仁油和蛋白提取率的影響。

(6) 攪拌速度的選擇：在物料粒徑200目、液料比8∶1 (mL/g)、浸提溫度60 ℃、提取時間4 h、浸提 pH 10的條件下進行試驗，考察攪拌速度(20，40，80，160，320 r/min)對核桃仁油和蛋白提取率的影響。

(7) 正交試驗設計：在單因素試驗基礎上，以物料粒徑、液料比、浸提pH、浸提溫度、提取時間和攪拌速度為因素，以核桃仁油和蛋白質提取率為指標，采用L8(27)優化光核桃仁油和蛋白質同步提取工藝參數。

1.2.4 核桃仁油和蛋白質提取率的計算

(1)

式中：

y——核桃仁油提取率，%；

m1——游離油I質量，g；

m2——游離油II質量，g；

m3——破乳油質量，g；

m4——桃仁樣品質量，g；

c1——樣品含油率，%。

(2)

式中：

z——蛋白質提取率，%；

m5——桃仁蛋白粉質量，g；

c2——桃仁蛋白粉中蛋白質含量，%；

m4——桃仁樣品質量，g；

c3——樣品蛋白質含量，%。

1.2.5 理化分析方法

(1) 核桃仁水分含量：常壓烘干法，按GB/T 14489.1—2008執行。

(2) 核桃仁油含量：索氏抽提法，按GB/T 14488.1—2008執行。

(3) 核桃仁及乳狀液粗蛋白含量：凱氏定氮法，按GB/T 14489.2—2008執行，其中乳狀液需先經冷凍解凍破乳去除大部分游離油后再進行消化。

(4) 乳狀液粗脂肪含量：采用羅茲—哥特里(Rose-Gottlieb)法[13]。

(5) 核桃仁油酸價：按GB/T 5530—2005執行。

(6) 核桃仁油過氧化值：按GB/T 5538—2005執行。

(7) 核桃仁油皂化值(以KOH計)：按GB/T 5534—2008執行。

(8) 核桃仁油氧化穩定性：按GB/T 21121—2007執行。

(9) 核桃仁油VE含量：按GB 5009.82—2016執行。

(10) 核桃仁油折光指數：用阿貝折光儀測定。

1.2.6 果仁油脂肪酸組成分析 參照GB 5009.168—2016用Agilent 7890A型氣相色譜儀內標法測定脂肪酸組成。

(1) 脂肪酸的甲酯化：稱取樣品0.5 g置50 mL離心管，加入5 mL正己烷，加入15 mL 10%乙酰氯—甲醇溶液，瓶口封死，在80 ℃水浴反應2 h，每隔20 min振搖1次，取出冷卻室溫，加入6%碳酸鈉10 mL，再加入5 mL正己烷，在振蕩儀振搖30 min，取出上清液過0.22 μm濾膜，上機檢測。

(2) GC分析條件：色譜柱Supelco SPTM-2560 (280 ℃，100 m×250 μm×0.2 μm)；檢測器類型FID；檢測器溫度250 ℃；進樣量1 μL；進樣口溫度240 ℃，分流比50∶1；流速1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度40 ℃，以3 ℃/min升到220 ℃，保持0 min，再以1 ℃/min升到230 ℃，保持230 ℃，總運行時間93 min。

1.3 數據分析

應用正交設計助手II 3.11作正交試驗設計及極差分析、方差分析和差異顯著性分析(P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著)；應用SPSS 18.0軟件計算標準誤差、單因素差異顯著性分析；應用Origin 8.0繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 光核桃果仁油和蛋白質同時提取工藝優化

2.1.1 單因素試驗結果 各因素對核桃仁油與蛋白質提取率的影響如圖1所示。桃仁粒徑越小，核桃仁油與蛋白質提取率明顯提高，200目提取率最高，之后降低；液料比為8∶1 (mL/g)時核桃仁油提取率和蛋白質提取率最高；光核桃仁蛋白在堿性溶液中隨著堿性增強而溶解度增大，而核桃仁油提取率在pH>9之后迅速下降；浸提溫度在50 ℃前，核桃仁油與蛋白質的提取率均隨溫度升高而增加，之后核桃仁油提取率小幅增加，而蛋白質的提取率在60 ℃后急劇下降，可能是蛋白質開始熱變性而沉淀；核桃仁油與蛋白質隨著提取時間延長而增加，4 h后增加幅度變??；攪拌速度為80 r/min時，兩者提取率最高之后，攪拌速度增加使乳化穩定性增加，導致兩者提取率均下降。

單因素試驗表明，適當粒徑有利于提高游離油脂和水解蛋白的提取率，粒徑過大，物料細胞完整率高，提取溶劑無法與完整細胞中的油脂和蛋白質接觸而不能充分地將其提取出來[14]。高油脂物料在干法粉碎過程中，因黏性大而容易結團，用傳統的粉碎機很難獲得小于20目的顆粒，在實際操作及文獻[15]均得到證實，而采用膠體磨濕法磨漿，可得到較小粒徑的物料，更有利于油脂和水解蛋白的提取。而粒徑過小導致油脂與蛋白在水中形成較穩定乳化體系，增加了破乳難度，是試驗過程中核桃仁油提取率偏低的主要原因。

2.1.2 正交優化提取工藝 根據單因素試驗的結果，確定L8(27)正交試驗的因子水平及編碼見表1。

圖1 單因素試驗結果Table 1 Results of individual factor experiment

表1 正交試驗因素水平編碼表Table 1 Code of factors and levels for the orthogonal L8(27)

由表2、3可知，在設置的水平范圍內，各因素對核桃仁油提取率影響的主次順序為粉碎度>pH>攪拌速度>時間>溫度>液料比，各因素在所取水平范圍內對核桃仁油提取率的影響均不顯著，其中液料比的極差小于空列極差，說明液料比在8∶1～10∶1 (mL/g)時對核桃仁油提取率無差異，核桃仁油最佳浸提條件為A1B1C2D1E2F1或A1B2C2D1E2F1，即：物料粒度150目、液料比8∶1 (mL/g)或10∶1 (mL/g)、pH 10、浸提溫度50 ℃、提取時間5 h、攪拌速度為80 r/min。

由表2、4可知，在設置的水平范圍內，各因素對蛋白質提取率影響的主次順序為時間>pH>溫度>攪拌速度>液料比>物料粒度，蛋白質最佳浸提條件為A1B1C1D1E1F2，即：物料粒度150目、液料比8∶1 (mL/g)、pH=8、浸提溫度50 ℃、提取時間4 h、攪拌速度為100 r/min。各因素在所取水平范圍內對蛋白質提取率的影響均不顯著。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of L8(27) orthogonal experiment

表3 核桃仁油提取率方差分析表?Table 3 Variance analysis of oil extraction rate

?F0.05=161，F0.01=4 052。

表4 蛋白質提取率方差分析表?Table 4 Variance analysis of protein extraction rate

?F0.05=161，F0.01=4 052。

2.1.3 驗證實驗 光核桃仁油與蛋白質最佳浸提條件時最優因素組合并不一致。為同時實現光核桃仁油和蛋白質的高提取率，分別對A1B1C2D1E2F1、A1B2C2D1E2F1和A1B1C1D1E1F2組合進行實驗驗證，結果如表5所示。

表5 3種優化組合的提取效果對比
Table 5 Compare of three optimization combinatorial methods on extraction yield(n=3)

%

由表5可知，A1B1C2D1E2F1組合與A1B2C2D1E2F1組合對油脂與蛋白質的提取率差異小，總體上A1B1C2D1E2F1組合略優于A1B2C2D1E2F1組合。A1B1C2D1E2F1組合對蛋白質的平均提取率僅比A1B1C1D1E1F2組合少0.59%，而A1B1C2D1E2F1組合對油脂的平均提取率比A1B1C1D1E1F2組合多2.30%。因此，選取A1B1C2D1E2F1組合為最優組合。

2.2 光核桃仁油主要理化指標測定

由表6可知，光核桃仁油的酸價為2.27 mg KOH/g，高酸價反映其中油游離脂肪酸含量高，高油游離脂肪酸使油脂容易水解酸??；碘值的高低與油脂中不飽和雙鍵的多少有關，雙鍵的數目越多碘值就越高，光核桃仁油碘值為123.64 g I2/100 g，說明不飽和雙鍵數量中等偏低；皂化值為208.26 mg/g，說明光核桃仁油中游離脂肪酸的含量比較大；過氧化值平均值為1.03 mmol/kg，說明光核桃仁油中的雙鍵被氧化程度低；氧化穩定性達12.4 h，表明光核桃仁油抵御自動氧化能力較強，這一特性可能與光核桃果仁油中抗氧化物質如VE等含量較高有關。

表6 光核桃仁油的主要理化性質Table 6 The main physicochemical property of Prunus mira nut oil

2.3 光核桃后油的脂肪酸組成

經過GC檢測分析得到脂肪酸甲酯標準品總離子流圖和光核桃仁油脂樣品離子流圖，見圖2。由表7可知，試驗所提取的光核桃仁油樣品檢測出12種脂肪酸甲酯，其中飽和脂肪酸7種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸2種。油脂以不飽和脂肪酸為主，相對含量89.43%，其中多不飽和脂肪酸相對含量為31.76%，單不飽和脂肪酸相對含量為57.67%。脂肪酸主要由順式油酸(57.32%)、亞油酸(31.65%)、棕櫚酸(6.49%)和硬脂酸(2.29%)組成，試驗提取的光核桃仁油與溶劑法提取的光核桃仁油脂均以油酸與亞油酸為主，總不飽和酸脂肪酸占90%左右。試驗提取的光核桃仁油樣品中發現了十三(烷)酸(1.58%)，其原因有待深入研究。光核桃仁油中的亞油酸含量比普通桃仁油的高11%～14%[16]，比苦杏仁油高出6.86%以上[17]。亞油酸是被最早認識的一種功能性多不飽和脂肪酸，在預防動脈粥樣硬化和心肌梗塞等心血管疾病方面有良好作用，亞油酸含量的高低通常作為植物油質量的重要指標之一。

表7 光核桃仁油主要脂肪酸組成與含量 Table 7 Quantitative analysis of main fatty acids in Prunus mira nut oil

圖2 光核桃仁油樣品脂肪酸甲酯離子流圖Figure 2 Chromatogram of Prunus mira nut oil fatty acid methyl esters

3 結論

(1) 通過L8(27)正交優化得到光核桃仁油脂和蛋白質的最佳同步提取工藝，結合破乳處理，獲得蛋白質提取率為(78.13±0.15)%、油脂提取率為(67.79±0.29)%。試驗可提取出蛋白質78%以上，前期研究[2,18]表明，光核桃仁蛋白質經酶解后所得的多肽具有良好的抗氧化性和抑菌活性。

(2) 試驗所提取得的光核桃仁油，酸價為2.27 mg KOH/g、碘值為123.64 g I2/100 g、過氧化值為1.03 mmol/kg、皂化值為208.26 mg/g、氧化穩定性達12.4 h；油脂樣品檢測出12種脂肪酸甲酯，其中飽和脂肪酸7種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸2種，油脂以不飽和脂肪酸為主，相對含量為89.43%，其中多不飽和脂肪酸相對百分含量為31.76%，單不飽和脂肪酸相對百分含量為57.67%。對照GB 2716—2018，試驗所制備的光核桃仁油質量優良。

(3) 試驗過程中油脂與蛋白質的提取率仍不理想，后續將探索破乳所用蛋白酶的種類、多種酶混合使用、或其他破乳方法來提高油脂得率，以及采用多次水提的方法來提高蛋白質的得率。