慢性阻塞性肺疾病伴認知障礙患者同型半胱氨酸、8-羥基脫氧鳥苷酸、血清淀粉樣蛋白A 水平變化及其與認知功能的相關性研究

郭陶陶，王晶晶，袁文杏，劉敏，張向民

慢性阻塞性肺疾病（COPD）主要特征是慢性氣流受限且呈進行性發展，主要發病原因為有害氣體或顆粒進入肺部而引發的炎性反應［1］。研究表明，COPD 發生于≥40 歲人群，且發病風隨年齡增長而升高，≥80歲人群COPD 發病率達28%［2］。COPD 患者不僅易并發心血管疾病、神經元損傷，且高達77%的COPD 患者會出現認知障礙，但具體發生機制目前尚不明確［3］。

同型半胱氨酸（Hcy）是含硫非必需氨基酸，血液中Hcy 因受外界因素影響而升高，易累積并形成高同型半胱酸血癥（HHcy）。研究表明，血漿Hcy 水平升高者阿爾茨海默病（AD）發生風險較血漿Hcy 水平未升高者增加1 倍，提示Hcy 在認知障礙發生過程中具有重要作用［4］。8-羥基脫氧鳥苷酸（8-OHdG）是DNA 氧化損傷的重要生物學標志物，COPD 患者血清8-OHdG水平明顯升高。氧化應激是引發AD 的重要機制之一［5］。血清淀粉樣蛋白A（SAA）是一種急性時相蛋白，正常狀態下其水平較低。研究表明，SAA不僅與COPD相關［6］，還可升高白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）等炎性因子水平，進而引發炎性反應，導致神經元丟失、腦白質損傷，并參與AD 的發生發展［7］。筆者推測Hcy、8-OHdG、SAA 可能是COPD 患者出現認知障礙的重要原因。本研究旨在探討COPD 伴認知障礙患者Hcy、8-OHdG、SAA 水平變化及其與認知功能的相關性，為COPD 患者認知障礙的早期預防和診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月—2018 年3 月邯鄲市第二醫院呼吸內科收治的COPD 患者88 例為COPD組，均符合《2011GOLD 慢性阻塞性肺疾病全球倡議：COPD 診斷、治療與預防 全球策略》［7］中的COPD 診斷標準，其中男50 例，女38 例；年齡39～84 歲，平均年齡（65.9±13.4）歲，另選取同期本院門診體檢健康者42 例為對照組，其中男23 例，女19 例；年齡40～83 歲，平均年齡（66.1±12.9）歲。對照組與COPD 組受試者性別（χ2=0.011）、年齡（t=3.589）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。根據認知功能將COPD 患者分為認知障礙組（n=57）和非認知障礙組（n=31）。納入標準：能夠完成相關量表測試者；未接受過糖皮質激素治療者。排除標準：有吸煙史、飲酒史及近期補充過葉酸和/或維生素B12者；合并心、腦、血管疾病及腎功能不全、糖尿病、惡性腫瘤、老年癡呆等者。本研究經邯鄲市第二醫院醫學倫理委員會審核批準，所有患者自愿簽署知情同意書。

1.2 認知功能 采用蒙特利爾認知評估量表（MoCA）評價所有受試者認知功能，包括視空間與執行能力、命名、注意力、語言、抽象、延遲回憶及定向力共7 項，滿分30 分，≥26 分為認知功能正常，＜26 分為認知障礙。

1.3 Hcy、8-OHdG、SAA 水平 所有受試者于早晨空腹狀態下抽取靜脈血4 ml，采用酶聯免疫吸附試驗檢測Hcy、8-OHdG、SAA 水平，試劑盒購自寧波瑞源生物科技有限公司。

1.4 Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對表達量 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR）檢測所有受試者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA mRNA 表達情況。應用Trizol 試劑盒提取總RNA，經勻漿、離心、與異丙醇混合、冰乙醇洗滌后采用分光光度法檢測波長為260 nm 時的RNA 純度和濃度，50 ℃ 20 min 反轉錄合成cDNA。后在qRT-PCR 標準反應系統混合物中加入SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，CA，USA）進行PCR 擴增，擴增系統為ABI 7500 Fast Real-Time PCR，擴增總體積為20 μl，其中基因引物對0.4 μl、cDNA 1 μl、3 mmol/L MgCl22.4 μl、SYBGreen 10 μl、蒸餾水6.2 μl，共40個熱循環。Hcy、8-OHdG、SAA 及β-actin 引物序列和擴增條件見表1，其中β-actin 為內參基因，采用2-ΔΔCT方法計算目的蛋白mRNA 相對表達量，每組實驗重復3 次取平均值。

表1 Hcy、8-OHdG、SAA 及β-actin 引物序列和擴增條件Table 1 Primers sequence and amplification conditons of Hcy，8-OHdG，SAA andβ-actin

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗；計數資料分析采用χ2檢驗；Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相對表達量與COPD 伴認知障礙患者MoCA 評分，Hcy 水平與COPD伴認知障礙患者8-OHdG、SAA 水平及Hcy mRNA 相對表達量與COPD 伴認知障礙患者8-OHdG、SAA mRNA相對表達量的相關性分析采用Pearson 相關。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MoCA 評分 三組受試者視空間與執行能力、命名、注意力、語言、抽象、延遲回憶、定向力評分及MoCA總分比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；認知障礙組患者視空間與執行能力、命名、注意力、語言、抽象、延遲回憶、定向力評分及MoCA 總分低于非認知障礙組、對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 Hcy、8-OHdG、SAA 水 平 三 組 受 試 者Hcy、8-OHdG、SAA 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；認知障礙組患者Hcy、8-OHdG、SAA 水平高于非認知障礙組、對照組，非認知障礙組患者Hcy、SAA 水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.3 Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對表達量 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；認知障礙組患者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對表達量高于非認知障礙組、對照組，非認知障礙組患者Hcy、SAA mRNA 相對表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

表3 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA 水平比較Table 3 Comparison of Hcy，8-OHdG and SAA levels in the three groups

表3 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA 水平比較Table 3 Comparison of Hcy，8-OHdG and SAA levels in the three groups

注：與對照組比較，aP＜0.05；與非認知障礙組比較，bP＜0.05

組別 例數 Hcy（mmol/L）8-OHdG（μg/L）SAA（mmol/L）對照組 42 13.25±1.21 11.25±1.58 45.78±15.22非認知障礙組 31 16.22±2.05a 12.25±1.02 75.52±10.84a認知障礙組 57 19.98±1.02ab 19.99±1.21ab 90.32±16.55ab F 值 4.006 4.092 4.297 P 值 0.028 0.026 0.021

表2 三組受試者MoCA 評分比較分）Table 2 Comparison of MoCA score in the three groups

表2 三組受試者MoCA 評分比較分）Table 2 Comparison of MoCA score in the three groups

注：與認知障礙組比較，aP＜0.05

組別 例數 視空間與執行能力 命名 注意力 語言 抽象 延遲回憶 定向力 總分對照組 42 3.85±1.20a 2.96±0.38a 5.93±1.02a 2.94±0.58a 1.99±0.39a 3.54±1.32a 5.99±1.63a 27.36±1.01a非認知障礙組 31 3.64±1.00a 2.68±0.42a 5.83±1.12a 2.96±0.89a 1.77±0.48a 3.25±0.45a 5.91±1.44a 26.15±0.81a認知障礙組 57 1.58±0.82 1.66±0.37 2.76±0.68 1.95±0.38 1.31±0.21 1.66±0.28 4.23±1.12 15.15±0.66 F 值 4.350 3.826 4.522 3.626 3.285 4.565 3.543 3.701 P 值 0.018 0.032 0.016 0.037 0.045 0.015 0.041 0.035

2.4 相關性分析 Pearson 相關性分析結果顯示，Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相對表達量與COPD 伴認知障礙患者MoCA 評分呈負相關（r 值分別為-0.456、-0.677、-0.413、-0.477、-0.699、-0.478，P＜0.05，見圖1、2）；Hcy 水平與COPD 伴認知障礙患者8-OHdG、SAA水平呈正相關（r值分別為0.335、0.442，P＜0.05，見圖3），且Hcy mRNA 相對表達量與8-OHdG、SAA mRNA 相對表達量亦呈正相關（r 值分別為0.365、0.441，P＜0.05，見圖4）。

表4 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對表達量比較Table 4 Comparison of relative mRNA expression quantity of Hcy，8-OHdG and SAA in the three groups

表4 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對表達量比較Table 4 Comparison of relative mRNA expression quantity of Hcy，8-OHdG and SAA in the three groups

注：與對照組比較，aP＜0.05；與非認知障礙組比較，bP＜0.05

組別 例數 Hcy 8-OHdG SAA對照組 42 0.326±0.028 0.316±0.029 0.422±0.030非認知障礙組 31 0.488±0.032a 0.359±0.028 0.715±0.024a認知障礙組 57 0.625±0.031ab 0.587±0.025ab 0.896±0.022ab F 值 3.869 3.701 3.785 P 值 0.031 0.035 0.033

圖1 Hcy、8-OHdG、SAA 水平與COPD 伴認知障礙患者MoCA 評分相關性的散點圖Figure 1 Scatter plots for correlations of Hcy，8-OHdG and SAA levels with MoCA score in COPD patients accompanied with cognitive disorder

3 討論

COPD 是一種免疫介導的炎性疾病，常伴發其他多種疾病，如心血管疾病、骨骼功能障礙等，目前已成為影響全球居民身體健康的疾病之一［8］。COPD 可導致視空間與執行能力減弱、注意力急劇下降、語言能力消退、抽象及延遲回憶淡化等認知障礙［3，9］，但目前其具體機制并不明確。研究表明，缺氧及高碳酸血癥引發腦內代謝紊亂、神經功能損傷可能是COPD 患者發生認識障礙的重要原因之一［10］。此外，多種分子通路如炎癥機制和氧化應激反應及相關因子也被認為是影響認知功能的潛在原因［5，11］。

已有研究表明，HHcy 是腦卒中、認知障礙、AD 等腦功能老化性疾病的危險因素［12］。而Hcy 不僅可通過誘導淀粉樣蛋白沉積及Tau 蛋白過磷酸化誘發AD，還可誘導炎癥和黏附因子聚集［13］。Hcy 氧化產生的自由基和過氧化氫（H2O2）可導致腦部缺血及缺氧，抑制神經傳導，導致認知功能損傷［14］。本研究結果顯示，認知障礙組患者Hcy 水平及其mRNA 相對表達量高于對照組、非認知障礙組，非認知障礙組患者Hcy 水平及其mRNA 相對表達量高于對照組；Hcy 水平及其mRNA 相對表達量與COPD伴認知障礙患者MoCA評分呈負相關，表明Hcy 與COPD 患者認知障礙有關，且Hcy 水平越高則患者認知功能損傷越嚴重。

COPD 患者常出現氧化應激反應，而8-OHdG 不僅是機體氧化應激反應的重要生物學標志物，還是機體代謝和修復能力下降的重要標志。當機體出現氧化應激反應時會產生大量活性氧，后者可通過毒性作用而損傷周圍組織活細胞，進而導致DNA損傷、細胞凋亡。研究表明，AD 患者大腦細胞核中8-OHdG 水平明顯升高［5］。本研究結果顯示，認知障礙組患者8-OHdG 水平及其mRNA相對表達量高于對照組、非認知障礙組，8-OHdG 水平及其mRNA 相對表達量與COPD 伴認知障礙患者MoCA評分呈負相關，提示COPD 伴認知障礙患者8-OHdG 水平較高，且8-OHdG 水平越高患者認知損傷程度越嚴重。

COPD 患者常表現出全身性炎性反應［15］。IL-6、TNF-α、白介素10（IL-10）等是常見的炎性因子，研究表明，上述炎性因子不僅在COPD 患者器官功能障礙中發揮重要作用，還參與了AD 的發病過程［11］。SAA在大腦中積聚過多可導致機體炎性因子水平升高，進而引發腦細胞炎性反應。研究表明，AD 患者SAA 水平明顯升高［7］，提示SAA 可通過調控炎性反應而導致認知障礙。本研究結果顯示，認知障礙組患者SAA 水平及其mRNA 相對表達量高于對照組、非認知障礙組，SAA水平及其mRNA 相對表達量與COPD 伴認知障礙患者MoCA 評分呈負相關，與上述研究結果相似。

有研究表明，COPD 患者Hcy 水平升高的同時一些炎性因子如C 反應蛋白（CRP）也會發生活化，提示Hcy可能通過調控炎性反應而參與COPD 發生發展［16］。此外，Hcy 水平升高還可促進機體發生氧化應激反應，導致8-OHdG 水平升高［17］。本研究結果顯示，Hcy 水平及其mRNA 相對表達量與COPD 伴認知障礙患者8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 均呈正相關，提示8-OHdG、SAA可作為Hcy 下游調控因子在COPD 患者認知障礙中發揮作用，但其具體機制仍有待進一步探討。

圖2 Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對表達量與COPD 伴認知障礙患者MoCA 評分相關性的散點圖Figure 2 Scatter plots for correlations of relative mRNA expression quantity of Hcy，8-OHdG and SAA with MoCA score in COPD patients accompanied with cognitive disorder

圖3 Hcy 水平與COPD 伴認知障礙患者8-OHdG、SAA 水平相關性的散點圖Figure 3 Scatter plots for correlations of Hcy with 8-OHdG and SAA in COPD patients accompanied with cognitive disorder

圖4 Hcy mRNA 相對表達量與COPD 伴認知障礙患者8-OHdG、SAA mRNA 相對表達量相關性的散點圖Figure 4 Scatter plots for relative mRNA expression quantity of Hcy with relative mRNA expression quantity of 8-OHdG and SAA in COPD patients accompanied with cognitive disorder

綜上所述，COPD 伴認知障礙患者Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相對表達量明顯升高，且Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相對表達量與COPD 伴認知障礙患者認知功能損傷程度呈負相關。

作者貢獻：郭陶陶進行文章的構思與設計并撰寫論文；王晶晶進行研究的實施與可行性分析；袁文杏進行數據收集、整理；劉敏進行統計學處理、結果分析與解釋；張向民進行論文修訂；郭陶陶、張向民負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。