用微創(chuàng)的心導(dǎo)管技術(shù)制作兔心肌梗死模型

周志文, 汪毓誠, 趙莉芳, 曹佳齊, 丁躍有, 劉惠東, 侯 磊, 昌 薇

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院/復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐匯醫(yī)院,1. 心內(nèi)科, 2.營養(yǎng)科, 上海200031;3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院心內(nèi)科, 上海200050)

心肌梗死(myocardial infarction，MI) 動物模型制作是探索冠心病、心力衰竭等心血管疾病病理生理機制和治療方法的重要環(huán)節(jié)。雖然豬、犬等大型動物MI模型有很多優(yōu)點，但對操作技能要求高，且購買、飼養(yǎng)等成本高，難以常規(guī)開展大規(guī)模的實驗，因而限制了其在科研中的應(yīng)用，而體型較小的動物如鼠類等MI模型，與人體差異較大，研究成果不利于向臨床轉(zhuǎn)化[1,2]。

兔作為中小體型動物，大小適中，價格相對較低，容易飼養(yǎng)與操作，且與人的生理特征較相似，較多應(yīng)用于心血管疾病的研究[2-4]。有關(guān)兔MI模型制作，國內(nèi)絕大多數(shù)仍是使用開胸法制作，極少有像豬、犬等大型動物一樣利用心臟導(dǎo)管微創(chuàng)技術(shù)制作MI模型[5]。

為此，本研究擬利用臨床常用的心臟導(dǎo)管微創(chuàng)技術(shù)及器械制作兔MI模型，利用臨床最常用的明膠海綿和彈簧圈作為小血管栓塞材料，旨在為研究MI等疾病的發(fā)病機制和治療方法等提供更多可選擇的科學(xué)實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

普通級新西蘭白兔20只, 雌雄不限，5～6月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg， 由上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場提供[SCXK(滬)2017-0008]; 在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動物實驗室進行實驗[SYXK(滬)2013-0106]。本研究得到上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(編號：201516)。小型DSA設(shè)備(ARCADIS Varic)購自德國Siemens公司，多導(dǎo)聯(lián)心電圖機(NIHON KOHDEN cardiofaxs ECG-1250) 購自上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司；裝有ECG Viewer II軟件的電腦。

1.2 冠狀動脈操作前準(zhǔn)備

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥溶液按1～1.5 mL/kg,用注射器多點肌肉內(nèi)注射將兔全身麻醉后，從耳緣靜脈建立靜脈通道。按200 U/kg從靜脈注入肝素。將4個別針分別刺入四肢，并與心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)相連，以記錄術(shù)中MI前后的心電圖。心電圖儀與裝有ECG軟件的個人電腦相連(動物的體表心電圖可輸入電腦，以備分析)[6]。將顆粒直徑710～1 000 μm明膠海綿顆粒栓塞劑(杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司，中國)混入2～3 mL造影劑[碘克沙醇注射液，16 g(I)/50 mL，楊子江藥業(yè)集團有限公司]中。

將頸部手術(shù)區(qū)的兔毛遞凈后，常規(guī)消毒鋪巾。沿正中切開皮膚，分離出左或右側(cè)頸動脈。利用臨床用的橈動脈穿刺針，采用Seldinger 技術(shù)穿刺頸動脈，置入5F血管鞘并固定[6]。和臨床冠狀動脈造影一樣，體外將三聯(lián)三通分別連造影劑泛影葡胺、生理鹽水、及壓力監(jiān)測系統(tǒng)。選用臨床常用的5F右冠狀動脈指引導(dǎo)管，并與三通管連接。

1.3 送微導(dǎo)管至冠狀動脈

將指引導(dǎo)管的頭端送入血管鞘。從指引導(dǎo)管內(nèi)送入超滑導(dǎo)絲。在X線的透視下，在超滑導(dǎo)絲指引下，緩慢將指引導(dǎo)管的頭端送至主動脈根部的竇底；其后撤出超滑導(dǎo)絲。

利用臨床常用的0.014英寸-180 cm的微導(dǎo)絲頭端塑型成一小彎，再送入大小為1.8F的Finecross微導(dǎo)管(Terumo公司, 日本)至其頭端; 沿指引導(dǎo)管將微導(dǎo)管送至指引導(dǎo)管的頭端。在排完空氣后，經(jīng)三通管向指引導(dǎo)管推注少許造影劑，顯示指引導(dǎo)管的頭端在主動脈竇底。緩慢調(diào)整指引導(dǎo)管，使其頭端靠近主動脈根部的左側(cè)。在注射造影劑的指引下，緩慢調(diào)整指引導(dǎo)管頭端，使導(dǎo)管頭端靠近左冠狀動脈開口, 造影顯示清晰的左冠狀動脈及左前降支[7,8]。緩慢送微導(dǎo)絲至左前降支遠端。其后固定指引導(dǎo)管和微導(dǎo)絲，沿微導(dǎo)絲緩慢推送微導(dǎo)管至左前降支近段或中段(視需求的MI程度而定)(圖1); 本研究為提高兔存活率，故微導(dǎo)管頭端均放置至左前降支的中段(第二對角支遠端)。

撤出微導(dǎo)絲，從微導(dǎo)管緩慢注射少許造影劑，行選擇性冠狀動脈造影，顯示出將要堵塞的目標(biāo)血管(圖2)。

1.4 實驗分組及制作MI

將實驗分成2組: 第一組從微導(dǎo)管注入明膠海綿顆粒栓塞劑混懸液1 mL，后利用微導(dǎo)管造影顯示左前降支閉塞無血流，或血流明顯減少(圖3);第二組沿微導(dǎo)管送入直徑0.018 英寸長為0.5 cm的彈簧圈(COOK Medical，丹麥)，在X線下可見彈簧圈送出微導(dǎo)管，至左前降支中段[8](圖4);心電圖顯示2組較MI前ST明顯缺血性改變(圖5)，MI模型制作成功。撥出微導(dǎo)管、指引導(dǎo)管及血管鞘。結(jié)扎頸動脈，止血后縫合皮膚。手術(shù)結(jié)束后送動物回籠，繼續(xù)飼養(yǎng)1個月。術(shù)后每日肌肉內(nèi)注射青霉素40萬單位，連續(xù)3d。

1.5 病理學(xué)觀察

術(shù)后飼養(yǎng)1個月后，全身麻醉后處死動物，取出心臟，觀察大體形態(tài)。標(biāo)本置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，沿心臟長軸中點橫切取材，切片4μm厚，用HE、Masson、天狼猩紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)改變，以及梗死區(qū)與正常供血區(qū)心肌染色，并測量MI面積[5]。梗死區(qū)與正常供血區(qū)心肌染色用全景掃描儀掃描整體切片，截取整體圖片保存用作分析。用IPP6.0軟件進行分析，并用此軟件讀取藍色顆粒所占面積，然后再讀取整體心臟面積，最后計算面積百分比，即可獲得MI面積。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 建模情況

利用25只兔實施本研究。早期由于操作缺乏經(jīng)驗，在送導(dǎo)管及注射造影劑時用力過大, 有3只兔在術(shù)中出現(xiàn)疑似主動脈撕裂及心包積液而死亡。后期改進, 導(dǎo)管在兔體內(nèi)操作時緩慢細(xì)致, 死亡明顯減少。3只兔因未能找到合適的左冠口, 或無法將微導(dǎo)管或微導(dǎo)絲送至左前降支, 未獲成功。

圖 1 指引導(dǎo)管、微導(dǎo)管及微導(dǎo)絲在左前降支

圖 2 經(jīng)微導(dǎo)管行左前降支造影

圖 3 經(jīng)微導(dǎo)管注入明絞海綿栓塞劑后再次造影

圖 4 經(jīng)微導(dǎo)管送彈簧圈至左前降支

圖 5 冠狀動脈閉塞前后心電圖

共19只兔成功送入微導(dǎo)絲及微導(dǎo)管至左前降支。彈簧圈組10只, 其中1只在送入彈簧圈時微導(dǎo)管彈出，彈簧圈釋放在主動脈竇底及左主干使兔死亡, 另2只在術(shù)中因室顫而死亡。因此，彈簧圈組兔獲7只MI制作成功，但術(shù)后飼養(yǎng)中死亡2只。明膠海綿顆粒栓塞劑組兔9只，其中1只術(shù)中因室顫死亡，1只術(shù)后約1 h死亡，因此，MI制作成功7只，但隨后飼養(yǎng)中死亡1只。2組實驗操作成功率相似且均較高(表1)。

所有兔在MI制作中，在冠狀動脈閉塞操作半小時內(nèi)均有ST段抬高(圖5)。術(shù)后兔恢復(fù)迅速，并正常飼養(yǎng)。

2.2 病理學(xué)檢查

飼養(yǎng)中死亡3只兔，取出所有死亡兔心臟，肉眼均看到明顯MI區(qū)。2組存活的兔在飼養(yǎng)1個月后全麻取出心臟行病理檢查。三種染色均發(fā)現(xiàn)左心室有明顯的MI區(qū)，2組兔MI面積差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (圖6，表1)。

圖 6 兔左心室MI病理學(xué)觀察

表 1 兩組實驗操作中兔存活及術(shù)后病理檢查情況對比

3 討論

兔冠狀動脈結(jié)構(gòu)特性與人基本相似，是制作MI模型的常用動物[2-4]。有關(guān)兔MI模型制作，傳統(tǒng)的開胸制作MI模型，常需要氣管插管及人工通氣供氧幫助[9]。開胸制作MI模型對動物創(chuàng)傷大，動物恢復(fù)慢，也容易造成心包粘連等，更不利于第二次開胸實驗。更為重要的是，開胸制作MI模型可能因為創(chuàng)傷大，不但干擾了病理生理代謝, 也常因為心包粘連影響心肌重構(gòu)等病理生理, 因此不利于MI及其后心衰等相關(guān)研究[7,10-12]。

Katsanos等[13]在無氣管插管、人工通氣供氧的情況下，利用導(dǎo)管技術(shù)制作MI實驗動物模型，觀察其心電圖、心臟彩超的變化及心肌組織學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)與開胸死亡無差別，證明了這種微創(chuàng)MI模型制作方法的可行性及有效性。而相比傳統(tǒng)的開胸法，非開胸的導(dǎo)管法制作兔MI模型有如下優(yōu)點：(1)較好地模擬人體內(nèi)冠狀動脈急性閉塞的情景，相比大多用開胸制作MI，非開胸法更貼近急性MI病理生理過程的特點；(2)操作簡單方便，無須開胸，創(chuàng)傷小，也減輕對家兔的損傷，利于動物的恢復(fù)；(3)由于不會致胸腔粘連，為第二次實驗手術(shù)提供極佳的MI模型，如干細(xì)胞注射等[7,8,13]。

本研究成功利用心臟導(dǎo)管臨床常用技術(shù)制作穩(wěn)定的兔MI模型，同時也發(fā)現(xiàn)，在左前降支內(nèi)，無論是放置彈簧圈，還是注射明絞海綿栓塞劑，用兩種方法制作兔MI模型成功率均較高，MI面積穩(wěn)定, 且無明顯差異。此外, 本研究僅為了制作MI，如需要制作心衰模型，則可將堵塞血管的部位升高，使MI面積更大，可明顯提高心衰制作成功率，但動物死亡率也可能更高。

在實驗操作方面，整體難度不大，大部分指引導(dǎo)管容易到達左冠狀動脈開口，但有些需反復(fù)耐心調(diào)整指引導(dǎo)管，方能達左冠狀動脈開口。同指引導(dǎo)管一樣，大部分微導(dǎo)絲容易到達左前降支，但有部分也需要耐心，反復(fù)緩慢調(diào)整導(dǎo)管與微導(dǎo)絲方能成功。只有小部分可能因冠狀動脈變異等原因，微導(dǎo)絲無法送至左冠狀動脈。微導(dǎo)管送入冠狀動脈后，操作應(yīng)盡量迅速，否則因微導(dǎo)管堵塞冠狀動脈血流時間過長，出現(xiàn)大面積心肌缺血，易出現(xiàn)室性心律失常甚至死亡。因此，在送入彈簧圈或栓塞劑后，應(yīng)盡快將微導(dǎo)管撤出。另外，模型制作過程中應(yīng)盡少用造影劑，以提高兔存活率。

總之，本研究探索的兔MI模型制作的微創(chuàng)技術(shù)和方法，操作簡單，使用方便，實用性強，對將來涉及心肌缺血、心衰疾病研究均有很大的科研及社會價值。