BALB/c小鼠經(jīng)不同途徑感染單純皰疹病毒Ⅱ型的病理學(xué)比較分析

程繼帥, 牟唐維, 柳 蕾, 吳化葉, 李琦涵

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所, 昆明650118)

單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2) 感染是最常見(jiàn)的性傳播感染之一，其為皰疹病毒科α病毒亞科成員，主要引起外生殖器感染和新生兒感染[1-3]。全世界年齡在14歲到49歲的人群中有超過(guò)5億人被感染[4]。HSV-2是一種具有生命周期的皰疹病毒, 周期性地脫落, 在沒(méi)有病灶的情況下, 攜帶者也可能會(huì)在生殖道脫落HSV-2[5]。HSV-2是復(fù)發(fā)性生殖器皰疹的主要原因，并且HSV-2攜帶者感染人類免疫缺陷病毒(HIV)的風(fēng)險(xiǎn)增加了3倍[6]。與HSV-1感染相似，原發(fā)性感染后HSV-2可擴(kuò)散至神經(jīng)系統(tǒng)，潛伏病毒可在感染個(gè)體的骶神經(jīng)節(jié)內(nèi)長(zhǎng)期存在，復(fù)發(fā)性感染通過(guò)激活潛伏在骶神經(jīng)節(jié)中的病毒而發(fā)生[7]。

盡管HSV-2感染成年人引起的疾病通常是輕微的，但它對(duì)新生兒和免疫功能低下的人群來(lái)說(shuō)可能是危及生命的，現(xiàn)已成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[8,9]。目前，治療HSV-2疾病的主要方法是系統(tǒng)地抗病毒，如阿昔洛韋等嘌呤核苷類似物可以部分降低HSV的傳播風(fēng)險(xiǎn)，但不能完全抑制病毒脫落[10]。因此，了解HSV-2的發(fā)病機(jī)制對(duì)防止病毒傳播、降低疾病發(fā)病率以及靶向抗病毒藥物和抗HSV-2疫苗的研制至關(guān)重要。

目前，研究人員[11-13]多采用眼角膜、后肢足墊、陰道、鼻腔等接種方式感染實(shí)驗(yàn)用小鼠，對(duì)其感染HSV-2后的免疫反應(yīng)進(jìn)行研究，少部分的研究人員[14]在獼猴模型中進(jìn)行HSV-2感染后生殖道黏膜的免疫學(xué)研究, 也有部分研究人員[15,16]在豚鼠及獼猴模型中進(jìn)行HSV-2疫苗的臨床前研究。盡管HSV-2感染可引起致命性的神經(jīng)性疾病，但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的研究較少。本研究擬采用不同的攻毒方式使成年雌性BALB/c小鼠感染HSV-2，觀察感染后小鼠的臨床表現(xiàn)，同時(shí)對(duì)攻毒部位和神經(jīng)組織進(jìn)行病理學(xué)分析，并對(duì)神經(jīng)組織的病毒載量進(jìn)行檢測(cè)，以期為HSV-2感染引起的神經(jīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量14～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)于本所SPF級(jí)屏障設(shè)施內(nèi)[SYXK(滇)K2014-0007]。實(shí)驗(yàn)操作在本所SPF級(jí)屏障設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，并通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查[DWSP201805012]，遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R和福利倫理原則。

1.2 主要試劑與儀器

主要儀器有: 高速低溫離心機(jī)(22R Centifuge),購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；熒光定量PCR儀(CFX96 Touch)，購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；酶標(biāo)儀(Eon)，購(gòu)自美國(guó)伯滕儀器有限公司等。主要試劑有：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；AxyPrep病毒DNA/RNA試劑盒，購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；PBS，購(gòu)自Gibco公司; 通用型組織固定液(中性)，購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 毒株

HSV-2 (病毒滴度2.5×106pfu/mL)，由本所病毒免疫室提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 小鼠隨機(jī)分為4組, 每組30只。陰道組、鼻腔組、眼角膜組分別經(jīng)陰道、鼻腔、眼角膜進(jìn)行攻毒，劑量為20μL/只；對(duì)照組則經(jīng)陰道注射PBS。

1.4.2 臨床表現(xiàn) 攻毒后，每日觀察小鼠的臨床體征(如是否弓背倒毛)、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、死亡情況等，持續(xù)觀察15 d，并監(jiān)測(cè)各組的體質(zhì)量變化。

1.4.3 組織病理分析 分別在感染后1 d、3 d、5 d和7 d, 每組取1只小鼠, 采用腹腔注射戊巴比妥鈉(150～200 ng/g體質(zhì)量)方法施行安死術(shù), 然后取其陰道、鼻腔、眼周皮膚; 在感染后3d、7d, 每組取1只小鼠, 施行安死術(shù)后取其腦和脊髓, 置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定3～5 d。固定好的組織經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色、封固后, 顯微鏡下觀察組織的病理變化情況。

1.4.4 病毒載量的檢測(cè) 在感染后1 d、3 d、5 d、7 d，每組分別取3只小鼠，施行安死術(shù)后取其腦和脊髓，稱重記錄，加入250 μL PBS緩沖液，組織勻漿后13 400×g離心5 min, 取上清200 μL轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，用AxyPrep病毒DNA/RNA試劑盒提取組織中的病毒DNA。按照Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 配制反應(yīng)體系，上機(jī)進(jìn)行QPCR，利用HSV-2標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品病毒DNA分子拷貝數(shù)[17]。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

陰道組小鼠感染5 d后表現(xiàn)外陰炎, 甚至外陰潰爛(圖1A); 眼角膜組小鼠感染5 d后表現(xiàn)角膜炎,甚至失明(圖1B)。鼻腔組小鼠未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。與對(duì)照組相比，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量均有下降，陰道組小鼠的體質(zhì)量在5 d、6 d顯著下降，而鼻腔組和角膜組小鼠的體質(zhì)量10 d后趨于穩(wěn)定(圖2)。陰道組小鼠在感染后9 d時(shí)，存活率已降為0; 鼻腔組小鼠在9 d時(shí)，存活率降為25%，之后未再繼續(xù)下降；而角膜組小鼠在9 d時(shí)存活率仍大于75%，且并未繼續(xù)下降(圖3)。

2.3 神經(jīng)組織病理變化

圖 1 BALB/c小鼠感染HSV-2后的臨床癥狀

圖 2 BALB/c小鼠感染HSV-2后的體質(zhì)量監(jiān)測(cè)

圖 3 BALB/c小鼠感染HSV-2后的存活情況

陰道組小鼠感染HSV-2后7 d可見(jiàn)腦組織局部神經(jīng)元間質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，大量神經(jīng)元細(xì)胞核固縮深染, 小范圍可見(jiàn)壞死液化, 伴有少量出血(圖5C);脊髓組織在感染后7 d可見(jiàn)血管周圍少量神經(jīng)元細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞壞死, 血管腔中可見(jiàn)少量白細(xì)胞，組織小范圍出血(圖5D)。角膜組小鼠感染后腦和脊髓組織未見(jiàn)明顯病理變化(圖5E、5F)。鼻腔組小鼠僅HSV-2感染后7 d的腦組織可見(jiàn)明顯的組織損傷及結(jié)構(gòu)破壞并伴有出血，大量神經(jīng)元細(xì)胞核固縮深染(圖5G)，而脊髓組織未見(jiàn)明顯的病理變化(圖5H)。

2.4 腦和脊髓組織病毒載量

各組小鼠腦組織中的病毒載量隨著感染時(shí)間的增加而增加，感染后7 d腦組織中的病毒載量最高，與對(duì)照組相比，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠的檢測(cè)結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。與腦組織相似，脊髓組織中的病毒載量隨著感染時(shí)間的增加而增加，在感染后7 d達(dá)到最大值，與對(duì)照組相比，感染后7 d的病毒載量均顯著上升(圖7)。

3 討論

HSV-2感染在全球多個(gè)地區(qū)高度流行，其傳播與年齡、性別、種族、性伴人數(shù)、文化程度、HIV感染等社會(huì)人口學(xué)因素有關(guān)[18,19]。HSV-2不僅可以經(jīng)性生活而且還可以經(jīng)唾液、生殖道分泌物進(jìn)行傳播。無(wú)典型臨床表現(xiàn)而存在間歇性病毒排放現(xiàn)象的感染者是目前最重要的傳染源[20]。本研究采用3種不同的攻毒方式使成年雌性BALB/c小鼠感染HSV-2，觀察感染后小鼠的臨床表現(xiàn)以及攻毒部位和神經(jīng)組織的病理變化，并對(duì)神經(jīng)組織的病毒載量進(jìn)行檢測(cè)分析。

圖 4 BALB/c小鼠感染HSV-2后攻毒部位的病理變化(HE×200)

本研究中HSV-2分別經(jīng)鼻腔、陰道、眼角膜感染小鼠, 臨床癥狀觀察發(fā)現(xiàn), 陰道組和角膜組均出現(xiàn)了不同程度的皮膚黏膜感染癥狀(如外陰炎、角膜炎), 而鼻腔組未觀察到明顯的臨床癥狀。攻毒部位的病理分析結(jié)果同樣佐證了臨床癥狀的觀察結(jié)果。鼻腔組鼻周皮膚切片未見(jiàn)明顯的病理變化, 而陰道組和角膜組分別在其攻毒部位表現(xiàn)出隨著感染時(shí)間的增加而加重的病理變化。有研究發(fā)現(xiàn), HSV-2不僅可以引起生殖系統(tǒng)感染, 也可引起其他皮膚黏膜(如口腔、鼻腔、眼睛等)的感染[21]。本研究中經(jīng)眼角膜感染HSV-2后引起了眼周皮膚的病理?yè)p傷, 同樣也證實(shí)了上述的研究觀點(diǎn)。

神經(jīng)組織的病理分析可以看到，鼻腔組和陰道組的腦組織感染后7 d均表現(xiàn)出明顯的組織損傷、結(jié)構(gòu)破壞、出血、細(xì)胞壞死等病理變化，且陰道組的脊髓組織也出現(xiàn)了相似的病理變化，而角膜組的神經(jīng)組織并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。神經(jīng)組織病毒載量的檢測(cè)結(jié)果顯示, 與對(duì)照組小鼠相比，感染HSV-2后各組小鼠腦和脊髓中HSV-2的病毒載量均顯著升高，且隨感染時(shí)間的增加而升高。盡管角膜組小鼠腦組織中的病毒載量高于鼻腔組和陰道組小鼠，但其腦組織并未出現(xiàn)明顯的病理變化；而陰道組小鼠脊髓組織中的病毒載量高于鼻腔組和角膜組小鼠，且其脊髓組織表現(xiàn)出明顯的病理變化。HSV-2病毒感染除了可以引起皮膚黏膜的感染，也會(huì)侵入神經(jīng)組織引起神經(jīng)組織的病理變化。病毒載量的檢測(cè)結(jié)果也可看到，鼻腔組和角膜組小鼠腦組織中的病毒載量較高于陰道組小鼠，而陰道組小鼠脊髓組織中的病毒載量較高于角膜組和鼻腔組，這就說(shuō)明病毒載量的高低可能與攻毒部位具有一定的聯(lián)系。小鼠存活情況也可知，陰道組在觀察周期尚未結(jié)束時(shí)存活率已為0，而鼻腔組小鼠在觀察周期結(jié)束時(shí)尚有27.27%，角膜組小鼠在觀察周期結(jié)束時(shí)仍有63.64%。結(jié)合神經(jīng)組織的病理學(xué)分析可知，病毒侵入神經(jīng)組織以及病毒造成神經(jīng)組織的病理?yè)p傷是導(dǎo)致小鼠死亡的重要原因。

圖 5 BALB/c小鼠感染HSV-2后神經(jīng)組織的病理變化 (HE×200)

本研究中，陰道組和角膜組小鼠均能較好地模擬HSV-2感染人后急性期表現(xiàn)出的皮膚和黏膜組織病理?yè)p傷的臨床癥狀，而鼻腔組小鼠感染后并不表現(xiàn)明顯的急性感染期癥狀，但在其神經(jīng)組織中有著較高的病毒潛伏，這與HSV-2病毒的潛伏感染特點(diǎn)相吻合。HSV-2感染后不僅能夠引起機(jī)體皮膚和黏膜的感染，同時(shí)也可侵入神經(jīng)組織，造成致死性的神經(jīng)組織病理變化。本研究為HSV-2感染的發(fā)病機(jī)制研究、治療藥物的藥效評(píng)價(jià)以及預(yù)防疫苗的臨床前研究提供了理論基礎(chǔ)。

圖 6 BALB/c小鼠感染HSV-2后腦組織中的病毒載量

圖 7 BALB/c小鼠感染HSV-2后脊髓組織中的病毒載量