雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞法制作血管性癡呆大鼠模型的行為學(xué)動(dòng)態(tài)評(píng)估

從 琳, 張智龍

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué), 天津 301617;2. 天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院, 天津 300120)

血管性癡呆(vascular dementia, VaD)以記憶的缺失和高級(jí)認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，現(xiàn)已成為繼阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)之后威脅高齡人群的第二大癡呆類型[1]，約占癡呆患者的15%～20%[2]。目前有多種造模方法用于建立VaD動(dòng)物模型，其中雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞(bilateral common carotid artery occlusion, BCCAO)法是制作VaD大鼠模型最常用的方法之一[3]。近年諸多實(shí)驗(yàn)探討如何降低BCCAO法制作模型動(dòng)物的死亡率[4-6]; 但此造模方法制作的VaD大鼠的認(rèn)知障礙篩選時(shí)間在各文獻(xiàn)報(bào)道中并不統(tǒng)一[7-10]。有學(xué)者[11]指出，有必要采用一套包含測試類型和測試時(shí)間點(diǎn)的認(rèn)知評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估VaD動(dòng)物模型。因此，本研究以BCCAO法制作VaD大鼠模型，記錄術(shù)后30 d內(nèi)的大鼠死亡率；并于術(shù)后30～34 d、60～64 d及90～94 d行Morris水迷宮(Morris water maze, MWM)行為學(xué)測試, 動(dòng)態(tài)觀察BCCAO術(shù)后大鼠的認(rèn)知功能, 以假手術(shù)組的逃避潛伏期均值評(píng)估BCCAO組大鼠的認(rèn)知障礙, 嘗試探尋評(píng)估VaD大鼠認(rèn)知障礙的適宜測試時(shí)間點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及環(huán)境

SPF級(jí)雄性SD大鼠70只，6～7周齡，體質(zhì)量(240±10) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0006]。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心[SYXK(津)2019-0002]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查批準(zhǔn)編號(hào)TCMLAEC2019017。飼養(yǎng)環(huán)境室內(nèi)溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，明暗各12 h光照控制。大鼠自由飲食。

1.2 試劑和儀器

戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司，69020181)。碘伏消毒液(山東瑞泰奇洗滌消毒科技有限公司，170814)。硫酸慶大霉素注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，1801141)。MWM設(shè)備及視頻分析系統(tǒng)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，ZS-001)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后, 以MWM測試剔除游泳障礙及逃避潛伏期數(shù)值極值的大鼠2只，保證實(shí)驗(yàn)大鼠智能無明顯差異。將68只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組9只，BCCAO法造模59只。

1.3.2 造模方法 采用2血管阻斷法(2-VO法)中的BCCAO法制作VaD模型。大鼠術(shù)前12 h禁食, 自由飲水。以0.6%戊巴比妥鈉腹腔注射(30 mg/kg)麻醉后，將大鼠仰臥固定于操作臺(tái), 頸部備皮, 碘伏常規(guī)消毒。切口位于頸部正中, 長度1～1.5 cm,剪開淺筋膜，鈍性分離二腹肌后腹、胸骨舌骨肌、胸乳突肌，暴露頸動(dòng)脈三角。鈍性游離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，用玻璃分針輕柔地將其分開，注意勿以金屬器械損傷迷走神經(jīng)。以4-0慕絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，絲線打結(jié)牢固，此時(shí)可見大鼠呼吸加深加快。切口處滴注硫酸慶大霉素?cái)?shù)滴，對(duì)齊切口皮膚，3-0手術(shù)線縫合3～4針，創(chuàng)口局部碘伏消毒。假手術(shù)方法同造模方法，但只分離頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎血管。

術(shù)中以加熱墊保證大鼠體溫，維持生命體征平穩(wěn)。術(shù)后將大鼠置于30～35 ℃通風(fēng)保溫箱，待蘇醒后送回籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。術(shù)后3 d，大鼠自由飲用10%蔗糖水溶液；并碘伏消毒創(chuàng)口后，局部滴注硫酸慶大霉素，以抗感染、降低死亡率。

1.3.3 行為學(xué)測試方法 以MWM定位航行試驗(yàn),考察大鼠的空間學(xué)習(xí)能力，動(dòng)態(tài)觀察BCCAO術(shù)后模型大鼠的認(rèn)知功能。MWM水缸呈圓形，高38 cm，直徑120 cm，缸底及內(nèi)側(cè)壁全部為墨黑色。配一高20 cm，直徑12 cm的金屬圓柱體，置于缸中作為大鼠逃避平臺(tái)。配套的系統(tǒng)顯示器將水缸從圓心處劃為四個(gè)象限，圓心正上方配有與計(jì)算機(jī)相連的攝像頭，實(shí)時(shí)同步記錄大鼠的游泳路線軌跡圖和各項(xiàng)數(shù)據(jù)。將金屬圓柱體置于缸中某象限近中心處作為平臺(tái)，向缸中注入清水，使水深沒過平臺(tái)1.5 cm；加少量黑色食品添加劑并攪拌均勻，使從水面觀察平臺(tái)，肉眼不可見；開啟設(shè)備加熱裝置，使水溫保持在(23±1) ℃。試驗(yàn)全程在暗室進(jìn)行。

圖 1 MWM設(shè)備及實(shí)驗(yàn)暗室環(huán)境Figure 1 MWM equipment and laboratory darkroom environment

每次測試的第一日上、下午，將大鼠分別從水缸兩對(duì)角象限的缸邊放入水中; 后4 d上、下午將大鼠分別從區(qū)別于前一日的兩對(duì)角象限放入水中。設(shè)定大鼠搜索到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)為90 s, 若大鼠90 s內(nèi)搜索到平臺(tái), 并在平臺(tái)上停留5 s, 則生成逃避潛伏期時(shí)間; 若90 s內(nèi)大鼠未能搜索到平臺(tái), 則逃避潛伏期時(shí)間為90 s, 此時(shí)需人為將大鼠引導(dǎo)至平臺(tái)停留10 s, 以助其記憶平臺(tái)位置。3次測試的逃避平臺(tái)放置于不同象限。

以假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期均值為參考值，計(jì)算BCCAO組大鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期比例，該值＞20%者判定為VaD大鼠[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，根據(jù)數(shù)據(jù)類型，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)；計(jì)量資料以x- ± s表示，3次檢測采用repeated measure ANOVA檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后死亡率

造模當(dāng)日至術(shù)后30 d：假手術(shù)組未見死亡大鼠；BCCAO組于手術(shù)當(dāng)日死亡大鼠5只，次日死亡3只，第3日死亡2只，第5日死亡1只，第12日死亡1只，此后至術(shù)后30 d未發(fā)生大鼠死亡。假手術(shù)組共存活大鼠9只，BCCAO組共存活大鼠47只(表1)。經(jīng)Fisher確切概率法檢驗(yàn)，2組死亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明BCCAO造模方法較為安全。

表 1 術(shù)后30 d內(nèi)大鼠死亡情況及死亡率Table 1 The death count and the mortality rate of rats within 30 days after operation

2.2 行為學(xué)測試

2.2.1 平均速度 表2結(jié)果顯示，隨著大鼠的生長，2組大鼠的平均速度均逐漸增快。經(jīng)repeated measure ANOVA檢驗(yàn)，大鼠在3次檢測中的平均速度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。平均速度與時(shí)間因素?zé)o交互作用(P=0.970＞0.05)，表明2組大鼠平均速度隨檢測時(shí)間的走勢無差異。在3個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)，2組大鼠的平均速度差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明較假手術(shù)組大鼠，BCCAO組大鼠不存在運(yùn)動(dòng)功能障礙，說明BCCAO組大鼠較假手術(shù)組大鼠出現(xiàn)的逃避潛伏期差異并非因動(dòng)力因素造成。

2.2.2 逃避潛伏期 表3結(jié)果顯示，隨著檢測次數(shù)的增多，2組大鼠的逃避潛伏期均逐漸下降。經(jīng)repeated measure ANOVA檢驗(yàn), 大鼠在3次檢測中的逃避潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。逃避潛伏期與時(shí)間因素?zé)o交互作用(P=0.138＞0.05)，表明2組大鼠逃避潛伏期隨檢測時(shí)間的走勢無差異。2組大鼠的逃避潛伏期，在術(shù)后30～34 d的檢測時(shí)間點(diǎn)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); 在術(shù)后60～64 d和90～94 d的檢測時(shí)間點(diǎn)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果表明在BCCAO造模術(shù)后30～34 d，BCCAO組大鼠較假手術(shù)組大鼠尚未出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙; 而在術(shù)后60～64 d及90～94 d的檢測中，較假手術(shù)組大鼠，BCCAO組大鼠已出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙。

表 2 大鼠3次行為學(xué)測試的平均速度Table 2 Average speed of rats in three behavioral tests cm/s

表 3 大鼠3次行為學(xué)測試的逃避潛伏期Table 3 Escaping latency of rat in three behavioral tests

2.2.3 VaD成模率 實(shí)驗(yàn)觀察期間對(duì)照組大鼠均未見VaD表現(xiàn)。術(shù)后30～34 d, BCCAO組出現(xiàn)VaD表現(xiàn)大鼠15只, 占31.91%。術(shù)后60～64 d、90～94 d,出現(xiàn)VaD表現(xiàn)大鼠分別占97.87%和95.65%。表明術(shù)后60 d時(shí), BCCAO術(shù)后大鼠已基本出現(xiàn)VaD表現(xiàn)。因此建議術(shù)后35～60 d篩選模型較為適宜。

3 討論

反復(fù)的腦缺血再灌注和長期慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)是VaD的主要病因[12]。經(jīng)多普勒血流儀測定, BCCAO法可使大鼠的全腦血流量下降70%[13], 造成大鼠CCH, 誘發(fā)白質(zhì)稀疏、海馬與皮質(zhì)神經(jīng)元損害等病理改變,最終導(dǎo)致大鼠漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙。此方法模擬了人類由動(dòng)脈粥樣硬化等慢性病導(dǎo)致的VaD[14]，且操作簡單，可重復(fù)性強(qiáng)，術(shù)后大鼠無明顯的感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙，因此是近年制作VaD大鼠模型最常用的造模方法之一[3]。

大鼠具有前循環(huán)頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)與后循環(huán)椎基底動(dòng)脈系統(tǒng)構(gòu)成的Willis動(dòng)脈環(huán)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后，亦可通過后循環(huán)代償及側(cè)支循環(huán)的建立，保證腦部供血[15]; 且價(jià)格低廉、易于存活、便于行為學(xué)及其他各種檢測，因此是以BCCAO法建立VaD模型最為適宜的動(dòng)物。雖然BCCAO法可對(duì)視網(wǎng)膜灌注產(chǎn)生損傷[16,17]，但SD大鼠與Wistar大鼠相比，視覺對(duì)行為學(xué)產(chǎn)生的影響較小[18], 且在BCCAO術(shù)后的死亡率低，體質(zhì)量恢復(fù)良好。文獻(xiàn)報(bào)道[19]雌激素可降低造模誘導(dǎo)的VaD, 且有學(xué)者[20]認(rèn)為2-VO法以體質(zhì)量230～270 g大鼠最為適宜。綜合文獻(xiàn)并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn), 本實(shí)驗(yàn)最終選擇體質(zhì)量230～250 g雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。較傳統(tǒng)BCCAO的操作方法[4-6], 本實(shí)驗(yàn)于術(shù)后3 d予大鼠自由飲用10%蔗糖水溶液, 最終BCCAO術(shù)后大鼠的死亡率低至20.3%。筆者認(rèn)為，上述操作或?yàn)锽CCAO造模方法的有益操作步驟。

MWM行為學(xué)測試，由英國心理學(xué)家Morris于1981年設(shè)計(jì)[21]。MWM經(jīng)不斷地改進(jìn)與應(yīng)用，現(xiàn)已成為考察大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力最為常用的實(shí)驗(yàn)裝置。水缸內(nèi)壁均呈墨黑色，實(shí)驗(yàn)時(shí)于清水中添加黑色食品添加劑，且試驗(yàn)操作全程在暗室進(jìn)行，配合以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，避免了由于本造模方法損傷視網(wǎng)膜灌注而可能對(duì)行為學(xué)產(chǎn)生的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BCCAO術(shù)后30～34 d至術(shù)后60～64 d的2次檢測，2組間的逃避潛伏期差異從不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)到出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明BCCAO術(shù)后大鼠的認(rèn)知功能隨時(shí)間的進(jìn)展呈漸進(jìn)性下降過程；在術(shù)后90～94 d的檢測中，2組間的逃避潛伏期差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 表明至術(shù)后90 d左右, BCCAO組大鼠的認(rèn)知障礙尚未恢復(fù)。可以推論，BCCAO術(shù)后，模型大鼠的VaD認(rèn)知障礙于術(shù)后35～60 d基本形成，并可持續(xù)至術(shù)后90 d。以上結(jié)果表明BCCAO法制作VaD大鼠模型，可誘發(fā)大鼠的認(rèn)知障礙，并可持續(xù)較長時(shí)間, 是制作VaD大鼠模型的可靠造模方法。本實(shí)驗(yàn)部分證實(shí)了先前的文獻(xiàn)報(bào)道[22-25]，但不完全一致，原因可能為認(rèn)知的損害程度受大鼠個(gè)體差異的影響較大；且實(shí)驗(yàn)大鼠的品種、鼠齡、體質(zhì)量及行為學(xué)測試裝置不盡相同。

本實(shí)驗(yàn)僅以MWM行為學(xué)測試動(dòng)態(tài)評(píng)估BCCAO術(shù)后大鼠的認(rèn)知功能，后期實(shí)驗(yàn)中期望引入以激光多普勒血流儀測定的腦血流量(cerebral blood flow, CBF)等客觀指標(biāo)。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn), 雖改變了逃避平臺(tái)的放置象限, 但2組大鼠的逃避潛伏期均持續(xù)下降。MWM的設(shè)計(jì)利用大鼠會(huì)游泳但怕水的天性, 對(duì)大鼠進(jìn)行應(yīng)激性刺激。此MWM檢測是否適宜重復(fù)進(jìn)行, 而且較跳臺(tái)法、避暗法、穿梭箱法、Y-迷宮、八臂迷宮、高架十字迷宮和新事物識(shí)別等行為學(xué)測試方法, 是否為評(píng)估VaD大鼠模型最適宜的方法尚不明確。以期上不足與疑問有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的探索, 以期進(jìn)一步完善BCCAO術(shù)后VaD大鼠的各項(xiàng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn), 使VaD大鼠模型能夠更好地服務(wù)于VaD的實(shí)驗(yàn)研究。

(致謝: 感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)場地。感謝盧軒師兄進(jìn)行教學(xué)模型制作，楊秀娟師姐協(xié)助模型制作，王栩師兄協(xié)助MWM行為學(xué)測試并指導(dǎo)論文撰寫與修改。)