不同防曬標準品對紫外線致大鼠皮膚光損傷的防護作用

徐穎愉, 黃曉輝, 江 漪, 李 敏, 龐增雄, 李光先, 陳秀娟, 陳梓靈, 孫 俠

(廣東質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院, 廣州 511447)

陽光中的紫外線(Ultraviolet)，主要是長波紫外線(Ultraviolet A，UVA)和中波紫外線(Ultraviolet B, UVB)可以對皮膚形成急、慢性損傷，從紅斑的形成、曬黑、膠原蛋白和彈性蛋白等大分子的合成減少，導(dǎo)致癌組織DNA突變等[1]。因此，皮膚光損傷除了皮膚紅斑、腫脹、松弛、色素沉著等各種表面損傷，還表現(xiàn)為膠原蛋白降解、彈性組織變性、棘層變厚等深層損傷[2]。

防曬化妝品可以減輕紫外線引起的皮膚損傷，為評價其防曬功效，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)推薦使用人體測試法[3]，其中UVB多用SPF值人體測試法，即通過紫外線照射人體皮膚后產(chǎn)生的紅斑效應(yīng)來計算防曬指數(shù)(SPF)值；UVA最為廣泛的評價方法是持續(xù)性色素黑化法(PPD法)，即通過紫外線照射人體皮膚后產(chǎn)生的黑化效應(yīng)來計算對UVA的防御能力(protection factor of UVA，PFA)值。但人體測試法只能反應(yīng)防曬化妝品對紫外線引起的表皮損傷的防護作用，卻不能檢測對皮膚深層光毒性損傷的防護作用。采用動物實驗的方法可以有效評價深層皮膚的損傷作用，但目前采用動物實驗方法評價防曬化妝品防曬功效的研究較少。

本研究參考孫俠等[4]UVA+UVB紫外線輻射的方法，建立紫外線致皮膚光毒性損傷實驗動物模型，結(jié)合毒性病理學(xué)評價方法，分析比較表皮厚度、皮脂腺橫截面積、皮膚損傷評分和表皮黑色素顆粒黑色素瘤特異性標記HMB45表達4個指標,以(SPF)和(PFA)防曬標準品為研究對象, 研究不同防曬標準品對紫外線誘導(dǎo)的大鼠皮膚光毒性損傷的防護，為全面評價防曬化妝品防曬功效提供毒理學(xué)評價方法和背景數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠, 28只, 體質(zhì)量180～220 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。動物飼養(yǎng)于廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院毒理實驗室[SYXK(粵)2014-0137]。動物實驗方法經(jīng)本單位動物福利和倫理委員會審核批準，所有操作均符合3R原則。

1.2 主要試劑

S1標準品(S1 Reference Standard, PFA值4.5,批號: 1003G)、S2標準品(S2 Reference Sunscreen,PFA值12，批號: 3102F)、P7標準品(P7 Low SPF Reference Standard，SPF值4.5，批號: 115I)、P2標準品(FDA SPF Standard Certified Formula P2 Certified Formula，SPF值16.5，批號：1902K)和P3標準品(P3 High SPF Reference Standard，SPF值16，批號：102J)均購自上海安普實驗科技股份有限公司；Anti-Melanoma抗體(產(chǎn)品編號:ab732，批號：GR3194686-3)購自英國Abcam公司；小鼠二步法試劑盒(產(chǎn)品編號：PV-6002，批號：K183316B)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

皮膚光毒性試驗檢測儀(型號：HOPE-MED 8130B)購自天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司；ES全封閉組織脫水機(型號：Excelsior)、組織包埋機(型號: HistoStar)、石蠟切片機(型號: HM340E)、烘片機(型號：Slimline Hotplate)、自動染片機(型號：Gemini AS)和自動封片機(型號：CTM 6)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；顯微鏡(型號：ZEISS Lab. A1)購自卡爾蔡司光學(xué)(中國)有限公司；電子天平(型號：雙杰JJ3000)購自雙杰電子天平公司。

1.4 分組與干預(yù)方法

將動物按表1方案隨機分成7組, 包括正常對照組、模型組和5個防曬標準品組。每次照射前,在大鼠背部3 cm×3 cm區(qū)域內(nèi)剃毛, 使皮膚充分暴露，將大鼠放在皮膚光毒性試驗檢測儀(UVA+UVB)燈具正下方的30 cm處照射，輻射參數(shù)設(shè)為UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+ UVB(0.036 mJ·cm-2·s-1)，每周照射2次，連續(xù)照射4周，8次照射時間分別為20 min、30 min、40min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，累計共440 min。各防曬標準品組每次照射前30 min涂抹防曬標準品，劑量為2 mg/cm2，每次照射完畢30 min后輕輕擦除。

1.5 檢測指標

1.5.1 病理學(xué)觀察 取照射部位皮膚，用質(zhì)量分數(shù)4%中性甲醛溶液固定，按常規(guī)步驟制作石蠟切片、進行H&E 染色, 光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。在高倍顯微鏡下，用ZEN2病理圖文分析軟件測量皮膚的表皮厚度和真皮層皮脂腺的橫截面積，參照GB7919-87《化妝品安全性評價程序和方法》[5]按文獻[4]標準進行皮膚損傷評分, 總分按(a+b+c+d+e+f+g+i+j+k)或(h+i+j+k)選擇總分較大者。

表 1 動物分組及處理Table 1 Grouping of the animals

1.5.2 免疫組織化學(xué)檢測 用小鼠二步法試劑盒檢測HMB45抗體的變化，可表達皮膚表皮層黑素細胞變化情況。

1.6 防護作用綜合評價

在表皮增厚、皮脂腺增生、皮膚損傷評分、HMB45表達這4項指標中有1項較模型對照組顯著減輕，可判其對紫外線輻射致皮膚光損傷有輕微防護功效；4項指標中有2項較模型對照組顯著減輕，可判其有輕度防護功效；4項指標中有3項較模型對照組顯著減輕，可判其有中度防護功效；4項指標均較模型對照組顯著減輕，可判其有高度防護功效。

1.7 統(tǒng)計分析

所測數(shù)據(jù)采用Excel錄入和SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用t檢驗、方差分析和多重比較(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚組織病理學(xué)觀察

正常對照組大鼠的背部皮膚表皮由角質(zhì)層、顆粒層、棘細胞層和基底細胞層構(gòu)成，顆粒層和棘細胞層的細胞數(shù)較少，表皮厚薄均勻；真皮層由乳頭層(真皮淺層)和網(wǎng)狀層(真皮深層)組成，膠原纖維是真皮結(jié)締組織中最為豐富的成分，彈力纖維數(shù)量較膠原纖維少，較均勻的散在分布在膠原束之間(圖1C-1); 真皮層皮膚附件由毛囊、皮脂腺組成，均未見明顯異常(圖1C-2)。模型組大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚), 棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5～2.9倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯, 真皮層少量膠原纖維變性伴少量成纖維細胞增生, 局部散在炎細胞浸潤(圖1M-1); 真皮層毛囊增大, 皮脂腺增生(圖1M-2)。S1組大鼠背部部分表皮角化過度(顆粒層增厚), 表皮增厚較模型組減輕(表皮為正常厚度1.2～1.9倍),真皮層少量成纖維細胞增生(圖1S1-1); 真皮層皮脂腺增生(圖1S1-2)。S2組大鼠背部皮膚表皮增厚較模型組明顯減輕(表皮為正常厚度1.0～1.2倍),真皮層散在成纖維細胞增生(圖1S2-1); 真皮層皮脂腺增生較模型組明顯減輕(圖1S2-2)。P7組SD雌性大鼠部分表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.4～1.9倍)，皺紋明顯, 真皮層散在的成纖維細胞增生(圖1P7-1);真皮層皮脂腺增生(圖1P7-2)。P3組大鼠部分表皮角化過度(顆粒層增厚), 表皮增厚較模型組減輕(表皮為正常厚度0.8～2.2倍), 真皮層散在的成纖維細胞增生(圖1P3-1); 真皮層皮脂腺增生(圖1P3-2)。P2組大鼠部分表皮角化過度(顆粒層增厚)，表皮增厚較模型組減輕(表皮為正常厚度1.3～1.6倍)，真皮層散在的成纖維細胞增生(圖1P2-1); 真皮層皮脂腺增生(圖1P2-2)。

2.2 HMB45免疫組織化學(xué)觀察

正常對照組皮膚未見明顯的HMB45表達(圖1C-3); 模型組局部皮膚可見少量細胞表達HMB45，表達部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層(圖1M-3); S1組局部皮膚可見少量細胞表達HMB45，表達部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層(圖1S1-3); P7組局部皮膚可見散在細胞表達HMB45, 表達部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層(圖1P7-3); S2組、P3組和P2組皮膚均未見明顯HMB45 的表達(圖1S2-3、圖1P3-3和圖1P2-3)。

2.3 各組大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積比較

表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積測定結(jié)果顯示(表2), 模型組較正常對照組顯著增厚(P＜0.05);5個防曬標準品組表皮增厚均較模型組顯著減輕(P＜0.05)。真皮層皮脂腺橫截面積測定結(jié)果顯示，模型組較正常對照組顯著增大(P＜0.05); S2組皮脂腺增生較模型組顯著減輕(P＜0.05)，其他防曬標準品組與模型組相比無顯著差異。

2.4 皮膚損傷評分

與正常對照組比較，模型組皮膚損傷評分顯著升高(P＜0.01); 與模型組比較，4個防曬標準品組皮膚損傷評分均顯著降低(P＜0.05)(表3)。

2.5 防護作用綜合評價

S2標準品有高度防曬功效，P3標準品和P2標準品有中度防曬功效，S1標準品有輕度防曬功效，P7標準品的防曬功效輕微(表4)。

圖 1 皮膚組織病理學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)觀察Figure 1 Histopathological and immunohistochemical observations of skin

3 討論

本研究采用UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+UVB(0.036mJ·cm-2·s-1)輻照方法，每周照射2次，連續(xù)4周，累計輻射時間440 min(UVA、UVB累計照射量分別為118.8 J·cm-2和1.0 J·cm-2)，建立皮膚光毒性損傷大鼠模型。與正常對照組比較，模型組SD雌性大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5～2.9倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯，少量表皮細胞空泡化；真皮層少量膠原纖維變性伴少量成纖維細胞增生，局部散在炎細胞浸潤，真皮層毛囊增大，皮脂腺增生，主要病變與文獻報道一致[6]。根據(jù)前期研究結(jié)果[4]，表皮增厚、皮脂腺增生、皮膚損傷評分可以較好地評估紫外線對皮膚的損傷作用。HMB45是能與黑素瘤抗原結(jié)合的單克隆抗體[7]，能識別前黑素小體球蛋白，并可與增生活躍的黑素瘤細胞和黑素細胞起反應(yīng)[8]，從而可用于評價皮膚黑色素細胞的增生情況。

表 2 各組SD大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積比較Table 2 Comparison of skin epidermal thickness and cross section area of sebaceous glands in dermis of SD rats in each group

表 3 各組SD大鼠皮膚損傷評分比較Table 3 Comparison of skin injury scores of SD rats in each group

表 4 各防曬標準品組防護作用綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of the protective effect of each sunscreen standard group

防曬化妝品對紫外線的防曬性能評價，目前國際上主要采用人體測試法和體外儀器測定法[9]，存在對人造成傷害、結(jié)果不準確等缺陷，而且對皮下組織損傷的防護不好直接判定。為解決這一難題，本研究建立動物模型來評價光毒性損傷。實驗結(jié)果顯示，S2組在表皮增厚、皮脂腺增生、皮膚損傷評分和HMB45表達4項指標均較模型組顯著減輕；P3組和P2組在表皮增厚、皮膚損傷評分和HMB45表達3項指標均較模型組顯著減輕；S1組在表皮增厚和皮膚損傷評分2項指標均較模型組顯著減輕；P7組僅在表皮增厚1項指標較模型組顯著減輕。從防護效果上講，各標準品對皮膚的防護作用存在差異，總體防護效果符合PFA和SPF值的大小。

本研究采用UVA+UVB紫外線輻射的方法，建立紫外線致皮膚光毒性損傷實驗動物模型，結(jié)合毒性病理學(xué)評價方法，分析比較表皮厚度、皮脂腺橫截面積、皮膚損傷評分和表皮黑色素顆粒HMB45表達4個指標，這些指標易于觀察和量化，相比人體SPF和SPA測試結(jié)果，更能直觀反映防曬化妝品對紫外線引起的皮膚深層光損傷的防護作用，可用于防曬化妝品防曬功效評價。