單碘乙酸誘導SD大鼠膝骨性關節炎模型在不同時間點與疾病進程的評價

肖昆林, 張 蕊, 孫 紅, 肖昆太, 馬建兵

(1. 廣州市花都區人民醫院, 廣州 510800;2. 西安交通大學附屬紅會醫院, 西安 710054;3. 廈門大學醫學院, 廈門 361000）

骨性關節炎(osteoarthritis, OA)是一種可導致患者出現嚴重殘疾的退行性關節疾病，以關節軟骨進行性破壞為主要特點，膝關節最常受累[1]。OA動物模型的建立是研究OA發病機制與治療方法的前提[2]。目前，OA動物模型建立的方法主要有外科手術、關節腔內注射藥物和自發性OA 3種[3]。外科手術構建OA模型的方法與臨床OA較為接近，但同時存在著創傷大、造模時間長等缺點。自發性OA模型與臨床OA最為相似，但其造模時間過長也不適合大力推廣。關節腔內注射藥物的建模方法所需時間較短，在疾病的研究中應用廣泛。常見的注射藥物有Ⅱ型膠原酶和碘乙酸鹽，碘乙酸鹽誘導的大鼠OA模型表現為關節軟骨破壞，軟骨下骨損傷，以及炎癥和關節疼痛等[4]。關節腔注射不同劑量單碘乙酸(MIA)及在不同的時間點, SD大鼠均呈現出OA病變, MIA注射的劑量1～10 mg/kg不等, 注射的時間1～8周不等[5,6]。然而目前為止, 尚無研究報道將OA疾病的進程和關節腔注射MIA的劑量和時間相聯系。本研究通過關節腔內注射中等劑量的MIA, 誘導膝OA大鼠模型，分別于注射MIA后1周、2周和4周處死大鼠進行觀察、檢測和關節軟骨組織病理學(OOCHAS)評分，并與臨床OA的發病進程相聯系，為后期OA發病和治療機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級2月齡雄性SD大鼠24只，體質量(210±18) g，2月齡購自西安交通大學醫學部動物實驗中心[SCXK(陜)-2018-001]。動物實驗在西安市紅會醫院轉化醫學中心進行，[SYXK(陜)2015-002]動物實驗通過西安市紅會醫院倫理委員會審查通過(編號IACUC2017-0819)。

1.2 實驗試劑及主要儀器設備

MIA、戊巴比妥均購自美國Sigma公司；微量注射器購自上海高鴿公司；乙二胺四乙酸(EDTA)購自科昊生物公司；質量分數4%多聚甲醛溶液購自Boster公司；OCT購自Tissue-Tek公司；HE染色試劑盒、甲苯胺藍染色試劑盒均購自Solarbio公司，冰凍切片機、解剖顯微鏡均購自Leica公司等。

1.3 膝骨性關節炎動物模型的建立

將SD大鼠隨機分成2組，即模型組(18只)和對照組(6只)。2組大鼠均用3%的戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉后，取右膝關節備皮，模型組大鼠右膝關節腔內注射溶于50 μL生理鹽水的2 mg MIA，對照組大鼠右膝關節腔內注射等量的生理鹽水, 隨后將大鼠放回籠內飼養(每籠3只),自由飲食。

1.4 形態學觀察及膝關節OOCHAS大體評分

關節腔內注射1周、2周和4周后，模型組大鼠采用空氣栓塞法處死每組各6只大鼠，對照組采用同樣的方法處死每組各2只大鼠，解剖取膝關節股骨髁和脛骨平臺軟骨組織，置于解剖顯微鏡下觀察并拍照。根據關節色澤、平滑度、關節液性狀以及關節面的磨損情況進行膝關節OOCHAS大體評分，本研究采用雙盲法進行評分。0分：關節面形態正常；1分：關節面具有輕微的纖維化(磨損、龜裂或剝落)或關節面輕微黃染；2分：關節軟骨缺損累計軟骨淺層和中層；3分：關節面缺損達軟骨深層；4分：關節面缺損累計軟骨全層，乃至軟骨下骨。

1.5 標本處理及切片制作

將關節標本置于質量分數4%的多聚甲醛溶液中固定，72 h后取出，置于質量分數12.5% 的EDTA溶液中脫鈣2周，隨后放入30%的高糖溶液進行沉糖，48h后取出，用冰凍切片包埋劑(OCT)進行包埋，于冰凍切片機中制作7 μm厚冰凍切片，并放于-20℃冰箱保存。

1.6 組織學染色及OOCHAS組織學評分

將組織切片分別進行伊紅-蘇木素(HE)及甲苯胺藍染色，并在光學顯微鏡下對染色結果進行拍照。根據關節軟骨結構、蛋白多糖含量、軟骨細胞聚集及數量、潮線完整度等方面，采用雙盲法進行OOCHAS組織學評分，累計0～12分為輕中度癥狀，13～24分為重度癥狀。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 膝關節面形態學觀察

圖1結果顯示，對照組大鼠膝關節軟骨面光滑，外觀呈淡紫色，軟骨面無充血、裂紋等。模型組大鼠造模1周后關節軟骨面略微粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；造模2周后關節軟骨面粗糙，光澤度消失，軟骨缺損深達軟骨中下層；造模4周后軟骨缺損累及軟骨全層，并深達軟骨下骨，股骨髁和脛骨平臺軟骨剝脫。

2.2 膝關節軟骨組織OOCHAS大體評分

對照組大鼠OOCHAS大體評分為0，造模1周和2周大鼠表現為關節軟骨的輕度損傷，4周表現為輕重度。單因素方差分析結果顯示, 造模后3個時間點大體評分分值差異具有統計學意義(圖2)。兩組間多重比較結果顯示，造模2周和4周相對于1周，4周相對于2周，分值均顯著提高，其中4周相對于1周，差異最顯著。

2.3 膝關節組織學染色結果

圖 1 大鼠膝關節組織形態學觀察Figure 1 Morphological observation of rat knee joint

圖 2 大鼠膝關節軟骨組織OOCHAS大體評分Figure 2 Rat knee joint OOCHAS gross score

對照組大鼠(圖3a、圖4a)軟骨表層無裂隙，表層細胞呈梭形，近似水平排列；中間層細胞為圓形，散在分布；深層細胞呈柱狀排列；潮線清晰；鈣化層細胞較大，呈散在分布，軟骨基質著色基本均勻。造模1周后見大鼠軟骨面出現小的裂隙，軟骨細胞數量輕度減少，潮線模糊，甲苯胺藍染色輕度變淡(圖3b、圖4b)。造模2周后大鼠關節軟骨組織破壞明顯，軟骨細胞數目明顯減少，潮線消失，甲苯胺藍染色明顯變淡(圖3c、圖4c)。造模4周后大鼠關節面缺損深達軟骨下骨，潮線周圍有新生血管出現，甲苯胺藍染色顯著變淡(圖3d、圖4d)。

2.4 OOCHAS組織學評分結果

圖 3 大鼠膝關節組織 HE 染色結果Figure 3 Representative histological images of HE staining after MIA intraarticular injection

圖 4 大鼠膝關節組織甲苯胺藍染色結果Figure 4 Representative histological images of toluidine blue staining after MIA intraarticular injection

對照組大鼠OOCHAS組織學評分為0，模型組大鼠1周和2周表現為輕中度OA，4周后表為輕重度。單因素方差分析結果顯示，造模后3個時間點大鼠OOCHAS組織學評分分值差異具有統計學意義。兩組間多重比較結果顯示, 造模2周和4周相對于1周，4周相對于2周，分值均顯著性提高，其中4周相對于1周，差異最顯著，與OOCHAS大體評分結果一致。

圖 5 造模后大鼠膝關節OOCHAS組織學評分Figure 5 The result of OOCHAS histological score of rat model after MIA intraarticular injection

3 討論

本研究通過關節腔內注射MIA的方法誘導OA大鼠模型, 結果顯示造模1周和2周后, 大鼠活動量逐漸減少, 關節軟骨面出現了大小不一的缺損,股骨和脛骨平臺軟骨變薄, OOCHAS大體評分和組織學評分顯示輕中度OA癥狀，與臨床OA早中期軟骨退變的表現相似; 造模4周后，大鼠活動量明顯減少，并逐漸出現跛行，關節軟骨面破壞加重, 呈糜爛狀, 軟骨缺損深達軟骨下骨層, OOCHAS大體評分和組織學評分顯示輕重度OA癥狀，與臨床晚期的軟骨退行性變的表現較為接近。

在以往的研究[7]報道中, 軟骨的病理損傷被作為評估OA各項指標的“金標準”。Morais等[8]通過關節腔內注射MIA的方法建立OA大鼠模型，發現該OA模型表現出軟骨細胞的變性和凋亡，即出現了軟骨損傷，最終膝關節間隙變窄，疼痛加重，與人的骨關節炎癥狀相似。進一步證實了關節腔內注射MIA建立OA大鼠模型是一個良好的方法，可以在相關研究中推廣使用。

OOCHAS評分體系由國際骨關節炎學會(OARSI)在1998年根據不同種類動物的OA軟骨組織退變特征和病理學特點所構建，是一套專門用于OA的評分體系，該評分系統從關節軟骨整體結構、蛋白多糖含量、軟骨細胞特性、潮線完整度、骨贅形成等五個方面分不同等級對軟骨損傷的程度進行評分，能夠實現對OA各個時期的病理損傷進行評價[9]。本研究對膝關節軟骨從宏觀形態學觀察，組織學染色，OOCHAS評分系統采用雙盲法進行評分，發現MIA誘導的膝OA大鼠模型，隨著時間的延長，膝關節軟骨呈進行性退變，軟骨細胞外基質蛋白聚糖成分含量逐漸降低，類似于臨床膝OA的發病進程。

關節軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞類型，通過合成和分解細胞外基質維持軟骨細胞外環境的穩定[10,11]。細胞外基質成分主要包括II型膠原和蛋白多糖[12]。Roberto等[5]通過向大鼠脛股關節腔內注射MIA，發現MIA對軟骨細胞中甘油醛-3磷酸脫氫酶的活性具有抑制作用，導致糖酵解中斷，細胞外基質蛋白聚糖合成的數量和質量下降，從而引起軟骨細胞凋亡。軟骨細胞的逐漸減少導致關節軟骨的組織學和形態學特征改變，最終產生與人OA癥狀相似的變化[13,14]。另外，用關節腔注射MIA的方法誘導OA動物模型，還具有創傷小、時間短、可重復性強以及相對容易操作等優點，已被應用于許多動物實驗[15-17]。雖然MIA誘導OA大鼠模型的方法已被廣泛應用，但也存在著一些不足之處，它沒有在多個時間點與人OA的發病進程相聯系和比較，而本文恰恰彌補了這個不足。

綜上所述，本研究通過關節腔內注射單碘乙酸成功誘導了膝OA模型，并將不同時間點的結果與臨床疾病進程相聯系，為后期功能和機制研究奠定了基礎。