潤(rùn)燥明目湯對(duì)急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜及其組織Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

萬(wàn) 宇, 李戰(zhàn)梅, 黃 海, 黃學(xué)文, 何藝嵐

(南充市中心醫(yī)院眼科, 南充 637000)

高眼壓癥是從原發(fā)性開角型青光眼的診治過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一種特殊癥狀，在臨床實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)確診的青光眼患者都具有眼壓升高的共同特征[1,2]。其發(fā)病機(jī)制尚未明確，但降低眼壓依然是治療青光眼最主要的措施之一。目前，青光眼的治療包括谷氨酸拮抗劑、基因調(diào)控、鈣離子阻滯劑等手段，但在不同的患者中其療效差別較大[3,4]。近年來(lái)，祖國(guó)醫(yī)學(xué)通過(guò)中醫(yī)針灸、中藥干預(yù)等特色療法在青光眼視神經(jīng)保護(hù)方面取得了重大進(jìn)展[5]。潤(rùn)燥明目湯對(duì)青光眼具有良好的效果，但關(guān)于其對(duì)高眼壓癥的療效研究報(bào)道較少。因此，本研究將通過(guò)構(gòu)建大鼠高眼壓動(dòng)物模型初步探討潤(rùn)燥明目湯保護(hù)急性高眼壓大鼠視神經(jīng)的作用及可能機(jī)制，旨在為臨床治療高眼壓癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(230±60) g, 購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所[SCXK(渝)-2017-0005]，飼養(yǎng)于南充市中心醫(yī)院外科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(渝)2017-0009]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南充市中心醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(文號(hào)20180516089)。潤(rùn)燥明目湯由我院藥劑科配置, 方劑包括生地12 g，丹皮l0 g, 白芍12 g，麥冬12 g, 石斛20 g，南沙參12 g，黃芪15 g，山茱萸12 g，淡竹葉9 g，置煎藥壺中加水煎煮30 min,去渣取汁，將汁濃縮為干膏, 其得膏率為18.2%。按不同劑量以灌胃方式給藥，每日1次。

Tono-penⅡ眼壓計(jì)購(gòu)自美國(guó)Medtronic SALON 公司, 光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡均購(gòu)自日本日立株式會(huì)社, 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷氨酸(Glu)及Ca2+試劑盒均購(gòu)自自南京建成生物工程研究所科技有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司。

1.2 模型構(gòu)建及分組

將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，根據(jù)處理方式的不同分為空白組、單純模型組、陽(yáng)性藥物組(銀杏葉片，210 mg/kg)、潤(rùn)燥明目湯低劑量組、中等劑量組及高劑量組?？瞻捉M: 不做任何處理,正常飼養(yǎng)，采用生理鹽水灌胃每日1次3 mL。單純模型組：參考趙瑛等[6]的方法建立大鼠急性高眼壓模型，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定，林可霉素沖洗眼部后行角膜表面麻醉。將生理鹽水瓶懸置于液平面至大鼠角膜頂點(diǎn)垂直距離136 cm處 (此高度可在大鼠眼內(nèi)形成 100 mmHg的眼內(nèi)壓[2])，將連接生理鹽水瓶輸液管的5號(hào)頭皮針針尖沿角膜緣刺人前房 ，為避免損傷虹膜和晶狀體，針頭斜面向上，針尖平行于瞳孔緣迅速推進(jìn)，切勿穿破角膜，固定 。輕輕打開輸液器開關(guān)，當(dāng)輸液瓶?jī)?nèi)的液體向眼內(nèi)滴注時(shí)，可見球結(jié)膜蒼白，虹膜迅速變白，用檢眼鏡檢查可發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜蒼白水腫，說(shuō)明視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈的供血已被完全阻斷。持續(xù)60 min后，緩慢拔除針頭，涂擦紅霉素眼膏預(yù)防感染。分籠飼養(yǎng)，自然飲食。陽(yáng)性藥物組、潤(rùn)燥明目湯低、中和高劑量組：急性高眼壓模型構(gòu)建方法同單純模型組，從造模第2日開始，采用潤(rùn)燥明目湯每日按10 mL/kg、15 mL/kg和20 mL/kg灌胃，給藥劑量換算為(按照臨床70 kg成人用量和體表面積進(jìn)行換算), 銀信葉片給藥劑量參考相關(guān)文獻(xiàn)。

1.3 大鼠眼壓測(cè)量

在造模前、造模后即刻、用藥后8周共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠眼壓進(jìn)行測(cè)量, 采用Tono-pen AVIA筆式眼壓計(jì)進(jìn)行。測(cè)量時(shí)，先采用奧布卡因滴眼液進(jìn)行表面麻醉，計(jì)量器輕觸角膜至少10次以上。記錄眼壓值。操作由1人完成，至少操作3次取平均值，測(cè)量過(guò)程中剔除顯著異常值。

1.4 HE染色

用藥8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用過(guò)量麻醉法處死大鼠，取下右眼眼球，留取部分眼球后視神經(jīng)組織，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定視神經(jīng)組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，烤片，冷卻后低溫凍存。經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇溶液梯度水化。蘇木精染色30～60 s, 沖洗5 min, 伊紅染色30 s，沖洗5 min; 乙醇溶液梯度脫水，干燥，二甲苯透明, 中性樹膠封固, 晾干, 光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+檢測(cè)

取下視網(wǎng)膜組織，摘除晶狀體和玻璃體，小心分離視網(wǎng)膜組織，移入EP管，吸進(jìn)水分后稱重，加入冰生理鹽水，剪碎。用破碎儀制作視網(wǎng)膜組織勻漿，在200r/min、室溫下離心8 min，分別參照SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+的說(shuō)明書操作方法，采用比色法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3 Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)

處死大鼠后, 解剖出視網(wǎng)膜組織。采用Trace試劑盒，提取DNA，洗脫后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA完整性。95 ℃預(yù)變性3 min, 95 ℃30 s, 退火溫度40 s, 72 ℃30 s, 40個(gè)循環(huán)，設(shè)置熒光反應(yīng)在每個(gè)擴(kuò)增周期后80℃10 s的條件下進(jìn)行，最后72 ℃持續(xù)5 min。引物模板見表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用s表示，組間比較的統(tǒng)計(jì)分析采用多因素方差分析檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表 1 CXCL12及CXCR4引物模板

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)眼壓比較

造模前, 各組大鼠的眼壓無(wú)明顯差異(P＞0.05)。造模后即刻，空白組無(wú)明顯變化，其他組大鼠眼壓顯著升高(P＜0.05)。用藥后8周, 高劑量組大鼠眼壓較模型組及低、中干預(yù)組顯著降低(P＜0.05),與陽(yáng)性藥物組相比高劑量干預(yù)組其眼壓變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)

正常組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)中視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整(圖1A)。單純模型組大鼠，視網(wǎng)膜組織明顯水腫，可見空泡變性(圖1B)。陽(yáng)性藥物組大鼠的神經(jīng)纖維層、細(xì)胞層水腫明顯較低，空泡樣變形較少，結(jié)構(gòu)截完整(圖1C)。潤(rùn)燥明目湯低劑量組及中劑量干預(yù)組大鼠的神經(jīng)纖維層、細(xì)胞層水腫明顯，空泡樣變性較多，結(jié)構(gòu)紊亂(圖1D、E)，而高劑量干預(yù)組的視網(wǎng)膜損傷程度明顯減輕，視網(wǎng)膜水腫位置較為局限，外層組織水腫顯著減輕，大部分結(jié)構(gòu)恢復(fù)(圖1F)。

表 2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)眼壓比較 mmHg

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+比較

與空白組大鼠相比，單純模型組大鼠視神經(jīng)組織中SOD活性顯著降低，而MDA、NO、Glu、Ca2+水平明顯升高(P＜0.05)。與單純模型組大鼠相比，陽(yáng)性藥物組及各干預(yù)劑量組大鼠的相關(guān)指標(biāo)均存在顯著變化(P＜0.05)。隨著治療劑量的升高，與陽(yáng)性藥物組相比，潤(rùn)燥明目湯高劑量干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜組織中NO、Glu水平呈顯著下降(P＜0.05)(表3)。

圖 1 各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色(HE×200)

表 3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+比較 (每mg視網(wǎng)膜組織)

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3平均積分吸光度

與空白組相比, 單純模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的Bcl-2吸光度明顯降低、Bax、Caspase-3平均積分吸光度均顯著升高(P＜0.05); 與單純模型組相比, 隨著潤(rùn)燥明目湯劑量的增加, 各劑量干預(yù)組及陽(yáng)性藥物組大鼠的Bcl-2平均積分吸光度均顯著增加, 其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), Bax、Caspase-3平均積分吸光度均顯著升高(P＜0.05); 與陽(yáng)性藥物組相比, 而高劑量干預(yù)組大鼠Bax、Caspase-3的平均積分吸光度顯著下降(P＜0.05)(表4)。

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

與空白組組相比, 單純模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Bcl-2 mRNA明顯降低、Bax、Caspase-3 mRNA均顯著升高(P＜0.05); 與單純模型組相比, 隨著給藥劑量的升高及陽(yáng)性藥物的干預(yù), 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸升高, Bax、Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降, 均呈現(xiàn)出劑量依賴性(P＜0.05); 與陽(yáng)性藥物組相比，高劑量潤(rùn)燥明目湯干預(yù)組大鼠Bcl-2及Bax mRNA明顯降低(P＜0.05)(表5)。

表 4 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3平均積分吸光度

表 5 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

絕大多數(shù)青光眼患者因眼壓升高導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)致盲性眼病。研究[7]報(bào)道，細(xì)胞凋亡參與青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失。其中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷及小梁細(xì)胞凋亡在青光眼發(fā)病過(guò)程中所發(fā)揮的作用引起研究者的關(guān)注。在高眼壓作用下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞染色體明顯濃縮、靠邊，胞質(zhì)中有多個(gè)比核小而濃縮的小體(即凋亡小體), 并有膜包繞。這種形態(tài)異常表明青光眼中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生凋亡。小梁網(wǎng)通常被認(rèn)為在眼內(nèi)壓調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用, 高眼壓狀態(tài)下, 小梁細(xì)胞凋亡被激活，啟動(dòng)凋亡程序，通過(guò)多種途徑打破 bcl2 家族的平衡，使 bax mRNA 表達(dá)量增加，bcl-2 mRNA表達(dá)量減少，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增加 。

由于缺乏警惕性，導(dǎo)致早期青光眼的隱匿性高，許多患者初次確診時(shí)就已難以根治、無(wú)法逆轉(zhuǎn)[8]。而在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中, 將青光眼歸于五風(fēng)內(nèi)障范疇, 病因病機(jī)與機(jī)械性損傷、缺血性損傷及免疫損傷等相似, 但關(guān)于其具體發(fā)病機(jī)制也無(wú)明確共識(shí)。

本研究中, 我們初步探討潤(rùn)燥明目湯對(duì)誘導(dǎo)大鼠高眼壓模型的保護(hù)機(jī)制。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)眼壓后發(fā)現(xiàn),在造模后即刻, 大鼠眼壓顯著升高, 表明模型構(gòu)造成功。用藥后8周，單純模型組、低劑量組、中劑量組眼壓無(wú)明顯差異，但高劑量組大鼠眼壓顯著降低, 表明高劑量的潤(rùn)燥明目湯對(duì)緩解眼高壓有一定的作用。經(jīng)HE染色后觀察視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，單純模型組大鼠的視網(wǎng)膜明顯水腫，各層結(jié)構(gòu)完整，可見空泡變性; 潤(rùn)燥明目湯低劑量干預(yù)組及中劑量干預(yù)組大鼠的神經(jīng)纖維層、細(xì)胞層水腫明顯，結(jié)構(gòu)紊亂; 高劑量干預(yù)組的視網(wǎng)膜損傷程度明顯減輕，視網(wǎng)膜水腫位置較為局限, 外層組織水腫顯著減輕, 大部分結(jié)構(gòu)已恢復(fù)。這表明，高劑量的潤(rùn)燥明目湯對(duì)受損的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有一定的改善功能，可部分恢復(fù)視神經(jīng)組織形態(tài), 這一結(jié)論與劉蓓等[9]研究結(jié)果相一致。

SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過(guò)氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用[10]。MDA是氧自由基與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其表達(dá)水平的高低可直接反映細(xì)胞氧化損傷的程度[11]。NO則可通過(guò)產(chǎn)生神經(jīng)毒作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。研究[6]表明，銀杏提取物抗氧化應(yīng)激、清除自由基、保護(hù)線粒體等多種生物功能，還能有效保護(hù)高眼壓模型的視神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。目前, 銀杏葉片已經(jīng)作為臨床用藥。在本研究中，將銀杏葉片作為陽(yáng)性藥物組，通過(guò)比色法檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與單純模型組相比，各給藥劑量組及陽(yáng)性藥物組的相關(guān)指標(biāo)均存在顯著差異，且與陽(yáng)性藥物組相比，高劑量干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜組織中NO、Glu水平呈顯著下降(P＜0.05)。這一結(jié)果表明，一定劑量的潤(rùn)燥明目湯可有效抑制自由基氧化作用的同時(shí), 其中對(duì)NO、Ca2+抑制作用強(qiáng)于銀杏葉片組，該結(jié)論與胡瑾等[13]研究結(jié)果相似。

Caspases家族成員是存在于胞質(zhì)溶膠中的半胱氨酸蛋白酶，可以選擇性地對(duì)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)進(jìn)行高效切割，參與調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程，如程序性細(xì)胞死亡，炎癥，細(xì)胞分化、增殖和運(yùn)動(dòng)[14]。BCL-2蛋白位于細(xì)胞內(nèi)膜如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體, 一些家族成員在細(xì)胞死亡的刺激下從細(xì)胞質(zhì)移位到線粒體[15], 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。在本研究中, 通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 隨著潤(rùn)燥明目湯干預(yù)劑量的升高, 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高, Bax mRNA、Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯下降，均呈現(xiàn)出劑量依賴性。而Caspases與細(xì)胞程序性死亡密切相關(guān)，當(dāng)出現(xiàn)高眼壓后，急性的缺血再灌注損傷會(huì)誘導(dǎo)大量視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡，作為細(xì)胞凋亡胞內(nèi)信號(hào)的主要傳遞者，Caspases表達(dá)量會(huì)明顯上調(diào)。在本研究中, 各干預(yù)組Caspase-3 mRNA及Bax mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)，表明潤(rùn)燥明目湯可通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase-3/Bcl-2/Bax信號(hào)通路活化發(fā)揮降低高眼壓、保護(hù)視神經(jīng)作用。

綜上所述，潤(rùn)燥明目湯干預(yù)急性高眼壓大鼠，對(duì)視神經(jīng)有明顯的保護(hù)作用，這可能與抑制Caspase-3/Bcl-2/Bax信號(hào)通路活性有關(guān)，為臨床上治療高眼壓患者的視神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但具體的分子學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。