黃芪注射液對db/db小鼠腎臟IL-1β、MCP-1和TNF-α的mRNA表達的影響

朱麗坤, 曹 爽, 蔣仕林, 尹曉琳

(河北省中醫院/河北醫科大學免疫教研室, 石家莊 050017)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常見的微血管炎癥的并發癥，主要表現為毛細血管間腎小球硬化癥，是1型糖尿病的主要死因，其機制復雜，以促炎因子為特征的慢性炎癥已被公認為是其發生的機制之一[1]。近年來不少中藥用于治療DN有明顯的療效，黃芪的應用也取得了一定的研究進展。黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根，其性微溫，可入肺經和脾經，具有補氣健脾、升陽舉陷、益衛固表、利尿消腫等功效[2]。已有研究發現，黃芪對細胞免疫、體液免疫和單核-巨噬細胞吞噬功能均有良好的促進作用，且臨床上用于治療DN有明顯的療效[3]。黃芪注射液是以黃芪為原料進行提取加工后的產物。db/db小鼠(diabetes mouse)由C57BL/KsJ近親交配常染色體隱性遺傳衍化而來，屬Ⅱ型糖尿病模型，在4周齡開始貪食及發胖，繼而產生高血糖、高血胰島素、胰高血糖素等，發生嚴重的糖尿病癥狀，并有明顯的腎病，一般在10個月內死亡。本次研究旨在通過檢測db/db小鼠炎癥細胞和炎癥因子的表達，探討黃芪注射液對于DN免疫細胞的調節作用，為完善黃芪注射液治療DN的免疫作用機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡SPF級C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2019-0009]，4周齡SPF級db/db小鼠購自北京大學醫學部實驗動物中心[SCXK(京)2016-0010]，飼養于河北醫科大學實驗動物中心[SYXK(冀)2018-003]。

1.2 主要儀器與試劑

全自動血細胞分析儀Sysmex 1800i, 購自日本Sysmex公司; 實時定量PCR儀, 購自美國AB公司; 流式細胞儀，購自美國BD公司；全自動酶標儀，購自美國Bio Tek公司; NanoDrop核酸濃度測量儀，購自美國Thermo Scientific公司；黃芪注射液(含黃芪生藥1g/mL)，購自神威藥業; 白細胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的ELISA試劑盒購自RayBiotec公司; IL-10、IL-1β、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)和TNF-α的mRNA檢測試劑盒購自生工公司；Real-time試劑盒購自日本TaKaRa公司；流式抗CD4、CD25、FoxP3標記抗體購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 動物處理及取材 C57BL/6鼠10只，雌雄各半，為對照組；db/db小鼠20只，雌雄各半，分為2組,每組10只，分別為糖尿病組和黃芪注射液治療組。對照組、糖尿病組小鼠每只每日腹腔注射100 μL PBS，黃芪注射液治療組小鼠按體質量每只每日腹腔注射100 μL黃芪注射液(濃度為1 g/mL)(因黃芪中的黃芪多糖經口給藥難以被吸收進入血液，故在此選擇腹腔注射的方式)，注射時間為12周。12周后摘除眼球取血，進行外周血白細胞計數及分類測定，提取血清測定細胞因子，取腎臟和脾臟組織分別進行Real -time PCR和流式細胞儀檢測。

1.3.2 小鼠白細胞計數和分類檢測 全自動血細胞分析儀測定小鼠白細胞計數及分類。

1.3.3 血清中IL-10和TNF-α的表達檢測 按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 目的基因mRNA表達檢測水平 提取小鼠腎臟組織的總RNA并對其濃度進行測定，RNA純度A260/A280在1.8～2.1。將上述總RNA反轉錄得到cDNA，然后以cDNA為模板, 擴增β-actin(內參),IL-1β, TNF-α和MCP-1。循環參數：總體積為10 μL，預變性 95 ℃ 30 s; PCR反應: 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；40個循環。數據處理使用相對定量值做統計學分析，柱形圖用平均值做。

1.3.5 脾臟中調節T細胞(Tregs)檢測 將脾臟研磨液置于離心管中, 離心棄上清，洗滌細胞后調節細胞濃度為1×106/mL，每管0.1 mL。試驗管加CD4和CD25各2 μL，避光保存20 min。洗滌后，加入破膜劑，再加入抗FoxP3抗體2μL。孵育20 min后，洗滌，再加入4%多聚甲醛溶液0.1mL放置10 min，后加蒸餾水2 mL放置10 min。離心棄上清后，用PBS懸起細胞，于流式細胞儀檢測Tregs。

1.3.6 統計學分析 實驗均重復3次, 用SPSS16.0統計軟件進行統計分析。所有數據均以s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血白細胞數量、中性粒細胞和單核細胞百分比

發現糖尿病組小鼠白細胞計數、中性粒細胞百分比和單核細胞百分比與對照組比較明顯上升，經過黃芪注射液治療后的糖尿病小鼠的白細胞計數、中性粒細胞百分比和單核細胞百分比均明顯下降(P＜0.05)(表1)。

2.2 黃芪注射液對血清中細胞因子變化的影響

糖尿病組小鼠的IL-10的含量與對照組比較明顯降低(P＜0.05); 黃芪注射液治療組小鼠IL-10的含量與糖尿病組比較有顯著升高(P＜0.05)。糖尿病組小鼠TNF-α的含量顯著高于對照組(P＜0.05);黃芪注射液治療組TNF-α的含量與糖尿病組相比又明顯降低(P＜0.05)(表2)。

表 1 不同組別小鼠白細胞計數、中性粒細胞百分比、單核細胞百分比的數值比較

表 2 不同組別小鼠血清IL-10和TNF-α的含量 pg/mL

2.3 小鼠腎臟炎癥因子的mRNA表達

與對照組小鼠IL-1β mRNA的表達量(0.97±0.31)相比，糖尿病組 (10.43±2.41)有明顯升高(P＜0.05)，而治療組(0.49±0.36)與糖尿病組相比則顯著降低(P＜0.05)。

與對照組小鼠MCP-1 mRNA的表達量(0.93±0.13)相比，糖尿病組(4.93±0.58)有明顯增高趨勢(P＜0.05)，而治療組(0.46±0.14)與糖尿病組相比有顯著降低趨勢(P＜0.05)。

與對照組小鼠TNF-α mRNA表達量(0.97±0.03)相比，糖尿病組(4.63±0.87)有明顯升高(P＜0.05)，而治療組(1.35±0.57)與糖尿病組相比有明顯降低(P＜0.05)。

2.4 黃芪對脾臟中Tregs細胞的影響

對照組小鼠的Tregs為2.42%±1.02%，糖尿病組的Tregs為3.53%±1.51%，黃芪注射液治療組為4.99%±2.53%(圖1)。黃芪注射液治療組與糖尿病組和對照組比較均明顯增加(P＜0.05)。

3 討論

DN是糖尿病患者最嚴重的并發癥之一。DN的發生和發展過程中有許多炎癥因子的參與，例如，轉化生長因子β、白細胞介素家族、趨化因子、黏附分子、Toll樣受體、脂肪因子、血管內皮生長因子等激發一系列的炎癥信號通路導致腎小管及腎間質纖維化、細胞外基質增厚，最終導致腎臟功能障礙[4]。目前，臨床上應用黃芪治療DN已有一定的療效，但其作用機制尚不完全清楚。我們通過對免疫細胞及細胞因子的研究，探索DN的炎癥反應及免疫作用機制。

有研究[5]表明，黃芪能夠提高中性粒細胞、巨噬細胞的吞噬以及殺菌功能，能夠促進細胞免疫以及體液免疫,但在糖尿病患者中黃芪能否減弱這些細胞的浸潤，延緩DN發生還未見報道。本研究結果發現，經過黃芪注射液治療的糖尿病小鼠白細胞總數、中性粒細胞百分比和單核細胞百分比較對照組均顯著下降，證實了黃芪注射液有抑制炎癥反應的作用。外周血白細胞的變化有望作為臨床輔助檢查，為DN患者的診斷與治療效果的評估提供科學依據。

有研究[6]證實，糖尿病早期無腎病等并發癥時, IL-10在炎性因素的刺激下水平升高, 而隨著糖尿病并發癥的出現, IL-10水平下降。本實驗發現糖尿病組的IL-10水平低于正常對照組, 而黃芪注射液治療組中黃芪注射液可以增加db/db鼠的Tregs數量, 并增加IL-10 的表達。這一現象說明黃芪注射液可能通過調節Tregs的數量和IL-10的表達抑制炎癥反應，預防腎臟炎癥的發生。

圖 1 黃芪注射液對小鼠脾臟中Tregs細胞的影響

在DN發展過程中, 巨噬細胞等免疫細胞及腎小管上皮細胞等被激活后可以分泌TNF-α等促炎因子，使炎性反應細胞聚集與黏附，循環微血管擴張，通透性增強，參與了腎小球組織損傷[7]。本研究發現糖尿病組小鼠血清中TNF-α的水平升高，而黃芪注射液治療組小鼠的TNF-α的血清蛋白表達水平與糖尿病組比較有所降低。說明黃芪注射液具有降低TNF-α的蛋白表達水平、減輕炎癥反應、延緩DN的進展的作用。從炎癥因子基因表達水平看，db/db小鼠經黃芪注射液治療后,腎臟的IL-1β、MCP-1和TNF-α的表達水平與治療前相比均有顯著降低，這與之前的相關文獻較一致，MCP-1可以促進巨噬細胞中單核細胞的轉化，產生多種細胞因子如IL-6和TNF-α等，可誘導血管壁中的動脈粥樣硬化，導致疾病進展，IL-1可修飾血管通透性和增加趨化因子的表達，從而導致腎小球膜細胞外基質的增殖和合成[8]。而治療組小鼠這幾個炎癥因子的顯著降低說明了黃芪注射液具有調節db/db小鼠腎臟的炎癥作用。為臨床應用黃芪注射液治療DN提供可靠的實驗依據，但其具體的作用機制有待進一步研究。