癲癇患者外周血miR-134表達及意義

王曉爽，國 琦，朱亞飛，樊雪梅，劉松巖

癲癇(epilepsy，EP)是由多種原因導致的腦部神經元高度同步化異常放電的臨床綜合征。癲癇病因錯綜復雜。目前控制癲癇發作仍以抗癲癇藥物為主，其次為手術治療[1]，仍有一部分最終發展為難治性癲癇。隨著分子遺傳學發展，近年來癲癇的分子病因已得到全面揭示[2,3]。研究表明微小核糖核酸(miRNAs)在癲癇發生中發揮重要作用[4]。miRNA參與樹突棘、突觸可塑性調節[5]，神經元壞死、凋亡、神經膠質細胞增生、異常通路形成以及炎癥反應等病理生理過程[6]，調節皮質發育及腦功能[7]，從而參與癲癇發生及調控[8]。miR-134是腦內一類特殊miRNA，對癲癇發生過程中多個病理生理過程起重要調控作用[9]，參與調控癲癇[10]、卒中[11]等多種神經系統疾病。miR-134在癲癇患者外周血是否存在差異表達，能否作為一種生物學標志物應用于預測細胞損傷、癲癇診斷、治療以及預后評估，是目前研究的熱點。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例隨機采集于吉林大學中日聯誼醫院門診及病區2013年12月-2017年12月就診的癲癇患者，根據腦電圖及臨床表現均符合國際抗癲癇聯盟癲癇診斷標準者為癲癇組(120例)，同時選擇年齡、性別相匹配的健康人為對照組(70例)，癲癇組根據病程、發作時限、發作頻率、特殊癲癇綜合征分為4個組，再進一步進行亞組分析(見表1)。癲癇組排除標準：年齡>80歲，中樞神經系統感染性疾病如單純皰疹病毒性腦炎、顱內占位性病變、邊緣葉腦炎；嚴重心臟、肝臟、腎臟、內分泌系統疾病者；妊娠及哺乳期婦女、嚴重智能障礙不能合作者。正常對照組納入標準：近期常規體檢包括心電圖、胸片、超聲無異常；血常規、血生化及肝腎功無明顯異常；無發作性癥狀、無癲癇家族史、無外傷史；無難產、腦炎、高熱驚厥史。

1.2 主要試劑 miR-134、U6引物購于上海生物工程公司；Trizol購于Ambion?公司；NCodeTMVILOTMmiRNA cDNA Synthesis Kit and Express Sybr?Green ERTMmiRNA qRTPCR Kits購于Invitrogen。

1.3 設計引物 根據miRBase尋找miR-134成熟體序列(MIMAT0000134)委托上海生物工程公司合成hsa-miR-134-5p RT-Primer序列為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT

ACGACCCCCTCTG-3’及隨機對照U6RT-Primer 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 實驗方法

1.4.1 外周血采集及保存 各組于清晨空腹采集肘靜脈血液,所取標本經處理后，于-80 ℃冰箱保存。

1.4.2 RNA的提取、逆轉錄及qPCR (1)RNA的提取:經裂解、分層、沉淀、洗滌、干燥、溶解等步驟提取RNA；(2)RNA濃度測定:使用NANODROP-2000可見分光光度計對所得樣本進行濃度及純度測定,記錄RNA濃度和OD260/OD280值,比值在1.9～2.0之間是表示RNA純度高，將樣本保存于-20 ℃冰箱；(3)將RNA逆轉錄為cDNA 逆轉錄反應條件如下：37 ℃ 60 min；95 ℃ 5 min；冷卻至4 ℃；(4)實時熒光定量PCR 每個樣品設3個重復，以U6 snRNA作為內參。qPCR反應條件：50 ℃，2 min；95 ℃，2 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40個循環；60 ℃～95 ℃溫度范圍內記錄熔解曲線。反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線，根據miR-134的CT、U6CT值，得出相對表達量(RQ，Relative Quantity)RQ=2-△△CT。

2 結 果

2.1 一般臨床資料比較 兩組間性別、年齡差異均無統計學意義(均P>0.05)(見表2)。

2.2 癲癇患者外周血miR-134表達 對提取得RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，總RNA電泳圖顯示無雜帶，表明RNA無降解(見圖1)。miR-134及U6擴增曲線平滑，溶解曲線單峰(見圖2)。統計學分析顯示，對照組(0.88±0.37)、癲癇組(2.38±0.47)，與對照組相比，癲癇組外周血miR-134表達量顯著升高，差異具有統計學意義t=-22.92，P=0.000(見圖3)。

2.3 病程對癲癇患者外周血miR-134表達影響 比較病程對外周血miR-134表達量影響，對照組(0.88±0.37)、病程≤1 y組(1.94±0.39)、病程>1 y組(2.56±0.37)，病程>1 y組與病程≤1 y組相比明顯升高，差異具有統計學意義，P=0.000，病程對癲癇患者外周血miR-134表達量有影響，病程長miR-134表達量增高(見圖4)。

2.4 發作時限對癲癇患者外周血miR-134表達量影響 比較發作時限對癲癇患者外周血miR-134表達量影響，正常對照組(0.88±0.37)、非急性發作組(1.92±0.35)、急性發作組(2.42±0.46)，與非急性發作組相比，急性發作組明顯升高，差異具有統計學意義P=0.000，發作時限對癲癇患者外周血miR-134表達量有影響，急性發作組miR-134表達量增高(見圖5)。

2.5 發作頻率對癲癇患者外周血miR-134表達量影響 比較發作頻率對癲癇患者外周血miR-134表達量影響，對照組(0.88±0.37)、頻繁發作組(2.37±0.49)、發作控制不良組(2.39±0.48)、發作控制良好組(2.38±0.46);頻繁發作組、發作控制不良組、發作控制良好組3組相比，F=0.013，P=0.987，無統計學差異(見圖6)。

2.6 特殊癲癇綜合征對癲癇患者外周血miR-134表達量影響 比較特殊癲癇綜合征(顳葉癲癇)對癲癇患者外周血miR-134表達量影響， 對照組(0.88±0.37)、非顳葉癲癇組(2.39±0.47)、顳葉癲癇組(2.36±0.48)，顳葉癲癇組與非顳葉癲癇組相比，P=0.764>0.05，差異無統計學意義(見圖7)。

表1 實驗分組

注：急性發作組：標本采集時3 d內存在臨床癲癇發作者；非急性發作組：標本采集3 m內無臨床癲癇發作者;頻繁發作組：發作次數≥ 4次/m；發作控制不良組：1次/m≤發作次數<4次/m；發作控制良好組：發作次數≤1～2次/y，不符合入組標準者排除

表2 研究對象分組及基本資料

注：a.獨立樣本t檢驗的P值；b.χ2檢驗的P值；“-”無相關數據

圖1 總RNA電泳圖

圖2 miR-134、U6溶解曲線及擴增曲線

圖3 癲癇患者外周血miR-134相對表達量，與對照組相比，癲癇組明顯升高P=0.000

圖4 癲癇患者外周血miR-134在不同病程組中表達，病程長表達量增高P=0.000

圖5 癲癇患者外周血miR-134在不同發作時限組中表達，急性發作組表達量升高P=0.000

圖6 癲癇患者外周血miR-134在不同發作頻率組中表達，發作頻率對表達量無影響P=0.987

圖7 癲癇患者外周血miR-134在特殊癲癇綜合征組中表達,特殊癲癇綜合征(顳葉癲癇)對表達量無影響P=0.764

3 討 論

miR-134是腦內含量豐富的一類特殊microRNA，廣泛分布于海馬神經元和樹突，在中樞神經系統中發揮重要調控作用[12]。樹突棘大小、密度及形態變化是影響癲癇發作的重要因素[13]。Schratt等[14]在研究miRNA與樹突棘之間聯系時發現，miR-134對樹突棘大小及數量起調節作用，大鼠海馬神經元中miR-134高表達，通過Limk1對樹突棘大小起調節作用，miR-134過表達，使樹突棘變小，miR-134對樹突棘的體積具有負向調節作用，從而影響突觸強度及突觸可塑性。當皮質神經元膜去極化時，miR-134 前體水平顯著增加[15]。由此推斷癲癇患者外周血miR-134表達量存在差異，本實驗結果中在對癲癇組和對照組比較時發現癲癇組外周血miR-134表達量明顯升高，支持此推斷，表明miR-134在外周血中穩定表達，這種差異表達提示miR-134可作為生物標志物深入細致研究，進一步探明其差異表達在癲癇調控中的意義。此種差異表達可能機制為神經元去極化導致miR-134水平明顯升高，通過轉錄后調節機制，調節相關靶蛋白，參與突觸可塑性調控，促使異常興奮性環路形成，最終參與癲癇發生發展。外周血miR-134穩定及差異表達，提示miR-134可能成為癲癇診斷、監測藥物敏感性、評估預后等特異性生物學標記物，為新藥開發提供理論支撐，為癲癇治療帶來新的希望。

突觸重塑、異常網絡形成既可能是癲癇反復發作原因，也可能是癲癇反復發作的興奮性毒性結果。我們的實驗結果得出癲癇患者外周血miR-134表達量在長病程組中明顯升高，推測外周血miR-134表達量可以在一定程度上反映突觸重塑、神經異常網絡形成等病理改變，外周血miR-134表達量變化可能為觀察腦損傷新的視角，為早期發現神經元損傷提供新的途徑，進而評估患者預后情況。

大量實驗表明[16]，miR-134與癇性發作有明顯時限性，在無鎂細胞外液誘導癲癇持續狀態(Status epilepticus，SE)離體細胞模型中，模型制備成功后72 h，miR-134表達升高，在應用miR-134抑制劑預處理的細胞中SE放電頻率較對照組明顯降低，神經元樹突棘密度減少。Jimenez-Mateos等[17]研究發現，在制備動物癲癇模型前24 h,側腦室注射antagomirs抑制miR-134表達，結果顯示海馬神經元破壞明顯減少，癲癇發作頻率明顯減少。SE可引起miR-134在海馬表達增加，有研究表明在實驗動物的海馬和難治性癲癇患者的顳葉皮質中miR-134的表達水平增高[18]。在鼠SE模型中，應用miRNA拮抗劑誘導使miR-134表達量下降，鼠癲癇自發性癲癇的發生率明顯下降，顳葉癲癇的病理特征有所減輕， 海馬CA3椎體神經元中樹突棘密度降低，增加海馬CA3錐體神經元棘突的體積，產生了有效的抗驚厥作用[19]。抑制大鼠海馬miR-134能夠減輕SE發作,可以縮短癲癇發作的潛伏期，縮短SE發作時間[20]。由此推測癲癇發作時限、發作頻率、特殊癲癇綜合征與外周血miR-134表達量相關，癲癇發作急性期、發作越頻繁，miR-134表達量越高，以及顳葉癲癇綜合征、miR-134的表達量升高，來評估顳葉癲癇反復發作的易感性，成為診斷特殊癲癇綜合征的輔助檢查之一。本實驗結果顯示，癲癇患者急性發作組miR-134表達量明顯升高，支撐上述推斷。但外周血miR-134在不同發作頻率以及特殊癲癇綜合征表達量無明顯差異,得出上述結果可能因樣本量較小有關，需要擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，我們的實驗結果發現癲癇組外周血miR-134表達量明顯升高，與病程、發作時限相關，提示miR-134表達與神經元放電程度和損傷嚴重性相關，可為我們進一步研究miR-134作為生物標志物以及應用miR-134抑制劑保護神經元提供理論支持；在癲癇急性發作組及長病程組高表達可能為癲癇預后判斷、療效評估提供幫助。