Tat結合蛋白30在胃癌腫瘤組織中的表達及其與患者預后的關系研究

劉慶偉，李勇，檀碧波，范立僑，趙群，李兆星，楊沛剛

胃癌是全球第二大常見惡性腫瘤，具有侵襲性強、預后差的特點。目前研究發現，胃癌的侵襲性與抑癌基因的突變密切相關[1]。Tat結合蛋白30（TIP30）是一種新發現的抑癌基因，通過抑制腫瘤細胞生長、促進細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、修復損傷DNA、調節腫瘤細胞葡萄糖耐量、抑制核轉運等途徑參與腫瘤細胞的發生發展[2-4]。TIP30在多種腫瘤組織中處于缺失或低表達狀態，并且其低表達與腫瘤患者的預后密切相關[5-6]。基質金屬蛋白酶9（MMP-9）可通過分解基底膜膠原蛋白促進腫瘤細胞侵襲轉移。目前國內外關于TIP30與胃癌相關性的研究鮮有報道，本研究旨通過檢驗TIP30、MMP-9在腫瘤組織中的表達水平及其相關性，探討TIP30與胃癌臨床病理特征、腫瘤侵襲間的關系，及其對患者預后的影響。

本研究價值：

（1）胃癌的侵襲性與多種抑癌基因的突變及其異常有關，Tat結合蛋白30（TIP30）是新近發現的一種腫瘤抑制因子，其具有多種功能，包括致瘤抑制、凋亡誘導和降低血管生成特性，但其是否改變胃癌患者預后以及與腫瘤侵襲轉移的關系尚未得到研究證實。

（2）劉慶偉等研究結果初步表明TIP30是胃癌患者的一個重要預后因子，且TIP30可能是一種潛在的抑制胃癌侵襲轉移的新靶點，為今后的體外實驗及體內試驗的開展提供了方向。

1 資料與方法

1.1 研究標準 納入標準：（1）有完整的臨床病歷資料，并經病理診斷確診；（2）均行根治性胃切除術聯合D2淋巴結清掃術，術前未接受過放化療治療。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）術中探查有遠處轉移；（3）姑息性手術切除原發病灶；（4）殘胃癌患者。

1.2 一般資料 收集2012年5月—2013年2月在河北醫科大學第四醫院行手術治療的106例胃癌患者的腫瘤組織石蠟標本，患者中男82例，女24例；平均年齡56（27，76）歲；腫瘤直徑：＜5 cm 45例，≥5 cm 61例；浸潤深度：T1～T239例，T3～T467例；分化程度：中/高分化65例，低分化41例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期29例，Ⅲ期70例；有淋巴結轉移43例。

另選取2017年就診于河北醫科大學第四醫院行胃鏡活檢的30例胃潰瘍患者，取其正常胃黏膜組織標本進行研究。納入標準：診斷為淺表胃炎、十二指腸炎者。排除標準：患者胃黏膜組織病理檢查結果為胃黏膜重度不典型增生。

上述標本采集均征得患者本人同意，本研究經河北醫科大學第四醫院倫理委員會審核通過。

1.3 采用免疫組化法檢測腫瘤組織和正常胃黏膜組織TIP30、MMP-9表達情況 石蠟切片脫蠟、乙醇脫水；加3% H2O237 ℃下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次×3 min；行抗原修復，山羊血清孵育，加TIP30抗體（1∶200）、MMP-9抗體（1∶200），4 ℃下孵育過夜；PBS沖洗3次×5 min；加生物素標記，37 ℃下孵育20 min；PBS沖洗3次×5 min；加辣根過氧化物酶標記，37 ℃下孵育30 min；PBS沖洗3次×5 min；加新配制的DAB顯色液，陽性顯色為棕黃色；自來水沖洗，蘇木素復染，乙醇脫水、透明，封固。PBS替代一抗作為陰性對照。

結果判定：由2位高年資經驗豐富的病理醫師指導收集病理標本和閱片，TIP30、MMP-9的陽性表達均定位于胞質，結果按半定量積分法判斷，根據陽性細胞所占比例及染色強度進行評分。不著色為0分，基本不著色（淡黃色）為1分，中等著色（棕黃色）為2分，強著色（棕褐色）為3分。著色細胞面積按陽性細胞占總細胞數的百分比判斷：陽性細胞占總細胞數的百分比≤5%為0分，6%～24%為1分，25%～49%為2分，≥50%為3分。兩項評分相加，0～1分為（-），2分為（+），3～4 分為（++），5～6分為（+++）；（+）～（+++）均表示陽性。

1.4 隨訪情況 隨訪截至2018-02-28。共隨訪3～60個月，中位隨訪時間35個月，采取電話、門診復查方式隨訪，復發轉移的患者均經影像學檢查及病理學檢查證實。生存期的計算從手術日期到由復發轉移而死亡的日期為止，或到隨訪截止日期。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析。偏態分布計量資料以M（P25，P75）表示；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析；采用Kaplan-Meier法繪制胃癌患者的生存曲線，通過Log-rank檢驗比較生存曲線的差異性；采用Cox比例風險回歸模型分析患者的預后因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TIP30在腫瘤組織及正常胃黏膜組織中的表達情況 TIP30在腫瘤組織中的陽性表達率為41.5%（44/106），低于正常胃黏膜組織的86.7%（26/30），差異有統計學意義（χ2=19.089，P＜0.001，見圖1）。

2.2 不同臨床特征患者腫瘤組織TIP30表達情況比較 不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度患者腫瘤組織中TIP30表達情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期患者腫瘤組織中TIP30表達情況比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 MMP-9在腫瘤組織及正常胃黏膜組織中的表達情況 MMP-9在腫瘤組織中的陽性表達率為82.1%（87/106），高于正常胃黏膜組織的23.3%（7/30），差異有統計學意義（χ2=37.800，P＜0.001，見圖2）。

2.4 不同臨床特征患者腫瘤組織中MMP-9表達情況比較 不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度患者腫瘤組織中MMP-9表達情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期患者腫瘤組織中MMP-9表達情況比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.5 腫瘤組織中TIP30、MMP-9表達情況的相關性分析 Spearman秩相關分析結果顯示，腫瘤組織中TIP30、MMP-9表達呈負相關（rs=-0.405，P＜0.001）。

2.6 不同TIP30表達情況的胃癌患者生存情況比較TIP30陽性表達的胃癌患者中位生存時間為45個月，TIP30陰性表達的胃癌患者中位生存時間為23個月；不同TIP30表達情況的胃癌患者生存曲線比較，差異有統計學意義（χ2=9.025，P=0.003，見圖3）。

圖1 TIP30在腫瘤組織及正常胃黏膜組織中的表達情況（免疫組化染色，×400）Figure 1 Expression of TIP30 protein in gastric cancer tissue and normal gastric mucosal tissues

表1 不同臨床特征患者腫瘤組織TIP30表達情況比較〔n（%）〕Table 1 Expression of TIP30 protein in gastric cancer patients by different clinical features

圖2 MMP-9在腫瘤組織及正常胃黏膜組織中的表達情況（免疫組化染色，×400）Figure 2 Expression of MMP-9 protein in gastric cancer tissues and normal gastric mucosa tissues

表2 不同臨床特征患者腫瘤組織中MMP-9表達情況比較〔n（%）〕Table 2 Expression of MMP-9 protein in gastric cancer patients by different clinical features

2.7 胃癌患者預后影響因素的Cox比例風險回歸模型分析 以患者預后情況（賦值：生存=0，死亡=1）為因變量，以性別（賦值：女=0，男=1）、年齡（賦值：＜60歲=0，≥60歲=1）、腫瘤直徑（賦值：＜5 cm=0，≥5 cm=1）、分化程度（賦值：中/高分化=0，低分化=1）、淋巴結轉移情況（賦值：有=1，無=0）、TNM分期（賦值：Ⅰ+Ⅱ期=0，Ⅲ期=1）、TIP30表達情況（賦值：陽性=1，陰性=0）為自變量，進行Cox比例風險回歸模型分析，結果顯示，淋巴結轉移情況〔HR=2.842，95%CI（1.597，5.057）〕、TIP30表達情況〔HR=0.517，95%CI（0.299，0.895）〕是胃癌患者預后的影響因素（P＜0.05，見表3）。

3 討論

胃癌根治性手術是改善患者預后最有效的手段，但50%～60%接受根治性手術切除的患者如T3/T4期的患者，其術后轉移及復發率高，5年生存率僅為30%左右[7]。然而臨床上常有處于同一腫瘤分期的胃癌患者預后不同，因此有必要尋找影響其預后的因素，從而使胃癌治療的療效最大化。

圖3 不同TIP30表達情況的胃癌患者生存曲線Figure 3 Survive curve of gastric cancer patients by the expression level of TIP30

表3 胃癌患者預后影響因素的Cox比例風險回歸模型分析Table 3 Cox proportional hazards regression analysis of prognostic factors for gastric cancer patients

TIP30是新發現的一種30 kD的Tat結合蛋白，TIP30基因又稱CC3或HTATIP2，是1997年發現的一種與腫瘤轉移抑制相關的基因[8]。TIP30基因具有促進腫瘤轉移、凋亡及血管形成等作用，并且在多種腫瘤細胞中均出現表達異常。CHEN等[9]研究發現，喉鱗狀細胞癌組織中TIP30表達水平顯著低于癌旁正常組織（46.7%比79.0%），TIP30表達水平也與其腫瘤分期、分化、淋巴結轉移情況密切向關。LIU等[10]研究發現，TIP30在膽囊腺癌中低表達，且與低分化、腫瘤腫塊大小、淋巴結轉移情況和腺癌浸潤程度密切相關。黃奇迪等[11]通過免疫組化法研究發現，TIP30在乳腺癌組織中的表達情況與TNM分期、淋巴結轉移情況、人表皮生長因子受體2（HER-2）和分子分型相關，其蛋白表達缺失可能導致腫瘤細胞的早期轉移，是乳腺癌患者預后的影響因素。樊麗偉等[12]研究發現，TIP30在結直腸腺瘤與結直腸癌中的表達水平明顯低于正常結直腸黏膜組織，TIP30表達水平隨著腺瘤絨毛成分及惡變率的增加而逐漸降低。本研究免疫組化法結果顯示，TIP30在腫瘤組織中的陽性表達率明顯低于正常胃黏膜組織，同時發現腫瘤的浸潤程度、淋巴結轉移情況、TNM分期與腫瘤組織中TIP30表達情況有關。多項研究結果表明，TIP30與腫瘤轉移密切相關，楊普等[13]研究結果顯示腫瘤組織中TIP30低表達的程度與腫瘤細胞轉移存在密切相關性，膠質瘤細胞的生長和體外侵襲能力可通過TIP30基因過表達被抑制[14]。通過抑制TIP30基因表達而增強EMT基因的表達從而促進胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力[15]。

基質金屬蛋白酶家族（MMPs）可以進一步降解細胞外基質中各種蛋白成分，分解侵襲的組織學屏障，促進腫瘤侵襲和轉移，其在胃癌侵襲轉移及預后中起關鍵作用。而MMP-9為MMPs中重要的一員，通過分解基底膜膠原蛋白從而促進腫瘤細胞侵襲轉移[16]。GUO等[17]研究發現，TIP30在胰腺癌組織中低表達，其表達降低與淋巴結轉移情況密切相關；在抑制TIP30表達后發現SW1990細胞MMP-9的表達上調、SW1990細胞侵襲和轉移能力增強。本研究結果顯示，MMP-9在腫瘤組織中陽性表達率明顯高于正常胃黏膜組織，不同浸潤程度、淋巴結轉移情況、TNM分期與腫瘤組織中MMP-9表達情況有關；分析TIP30、MMP-9在腫瘤組織中的相關性發現，二者存在明顯的負相關性，提示TIP30可能通過調控MMP-9促進腫瘤的侵襲轉移。生存分析結果顯示，不同TIP30表達情況的胃癌患者生存曲線比較，差異有統計學意義；Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，淋巴結轉移情況、TIP30表達情況是胃癌患者預后的影響因素，表明TIP30表達陽性、無淋巴結轉移情況的胃癌患者預后較好，生存期明顯延長。

綜上所述，TIP30在胃癌腫瘤組織中低表達，且與腫瘤的侵襲轉移有關，同時是患者預后的影響因素。但本研究尚存在一定的不足之處，例如TNM分期是目前公認的重要的預后因素，其在本研究結果中并未得到陽性結果，可能與Ⅰ、Ⅱ期樣本量少有關，有待于今后更進一步的研究證實。

作者貢獻：劉慶偉進行文章的構思與設計，撰寫論文；李勇進行研究的實施與可行性分析，對文章整體負責，監督管理；檀碧波、范立僑、趙群負責文章的質量控制及審校；李兆星、楊沛剛負責數據收集、整理，進行基礎實驗、統計分析。

本文無利益沖突。