海南省新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥發生情況及基因突變分析研究

趙振東，王潔

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥是一種G6PD基因突變引起的X連鎖不完全顯性遺傳性溶血性酶缺陷疾病，該病是引起蠶豆病、感染性溶血、藥物性溶血以及新生兒高膽紅素血癥等的重要原因，全球約4億人口罹患此病[1]。目前已發現G6PD基因有400多個基因突變類型[2]，而我國已檢出25種，且多分布在外顯子區[3]。G6PD缺乏癥在我國南方地區發病率高，尤以廣東、廣西以及海南地區發病率最高[4]。迄今為止未見海南省全省人群大規模G6PD基因調查分析，故本研究選取2017年出生的全海南省新生兒進行G6PD基因篩查，分析海南省新生兒G6PD基因突變類型及其分布特點，旨在為優生優育提供科學依據。

本研究價值：

（1）全球約4億人口罹患葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥。據報道已發現400多個基因突變，而我國已報道25種突變類型，除IVS-5 636/637T del、IVS-5 C134T和IVS11 93T＞C（SNP）在內含子區外，余者分布在外顯子區。雖然平素可無任何癥狀，如遇誘因可引發急性溶血性貧血而導致死亡，目前尚無有效的根治措施，該病在海南省高發，因此在海南省開展新生兒大規模的G6PD缺乏癥篩查和基因診斷，做到早發現早預防顯得尤為重要。

（2）趙振東等研究結果顯示，海南省新生兒G6PD缺乏癥發生率較高，且基因突變類型豐富，特別是海南省特有少數民族——黎族的G6PD缺乏癥發生率顯著高于漢族。同時，G6PD缺乏癥基因突變類型以c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G 和 c.1024C＞T 為主；且發現 5例未知突變，其中 c.86C＞T、c.487G＞A和c.1004C＞A突變各有1例，屬于海南省人群的首次報道。該結論有利于G6PD缺乏癥的防治，為后續基因突變導致的不同臨床表型研究奠定了分子基礎。

本研究局限性：

受限于檢測樣本量以及相關經費等一些原因，目前只檢測了2017年的樣本，另外受限于患者意愿等因素還有2例未知突變未能抽血進行基因測序。另外限于熔解曲線法檢測探針覆蓋序列變異范圍，本研究只報道了檢測到16種中國人群常見變異位點中10種變異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取全海南省內各助產單位2017-01-01至2017-12-31出生的活產新生兒130 512例，其中男71 531例，女58 981例。依據《新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查與診斷實驗室檢測技術專家共識》[5]（簡稱：G6PD專家共識）指出的G6PD篩查要求，以出生滿72 h并充分哺乳8次以上為納入標準。采集符合納入標準的新生兒的足跟血制成濾紙干血片，用于G6PD基因初篩。抽取初篩可疑樣本2 ml靜脈血于EDTA-K2抗凝管，用WHO推薦的G6PD/6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6GPD）比值法進行生化檢查確診。生化檢查確診為G6PD缺乏癥的患兒，找出其干血片進行基因分型。檢驗前進行樣本的質量控制：（1）初篩干血片質量控制：水平晾干后密封于封口袋內，3 d內通過新生兒疾病篩查標本冷鏈物流服務項目運送至海南省新生兒篩查中心實驗室立即檢測，未能立即檢測的樣本于-20 ℃冷柜保存；（2）生化檢查確診抗凝血樣本質量控制：定期召回初篩可疑病例，采集其靜脈血置于EDTA-K2抗凝管中，搖勻，立即送檢，當天進行檢測。

本研究經海南省婦幼保健院倫理委員會批準〔海南省婦幼保健院（2018）倫審第（37）號〕，患兒家長均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 儀器 全自動熒光免疫分析儀（2021GSP）、自動打孔儀（2081Panthera-PuncherTM9）、日立7060生化儀、ABSON MicBio-IV型孵育振蕩器、核酸提取儀（Lab-AidTM 824）及伯樂Bio-Rad CFX96型實時PCR擴增儀。

1.2.2 試劑 珀金埃爾默股份有限公司G6PD測定試劑盒、廣州米基科技發展有限公司G6PD/6GPD試劑盒、廈門致善生物科技股份有限公司Lab-Aid核酸提取Micro試劑盒和G6PD熒光PCR熔解曲線法基因突變檢測試劑盒（可檢測中國人常見的16種G6PD基因突變類 型：c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.383T＞C、c.95A＞G、c.1387C＞T、c.392G＞T、c.1360C＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1381G＞A、c.493A＞G、c.519C＞T）。

1.2.3 試驗方法

1.2.3.1 G6PD基因篩查試驗 嚴格按照試劑盒說明書進行操作，使用G6PD測定試劑盒，即GSP熒光分析法對新生兒干血片上GSP進行初篩。結果判讀標準：測量值≤2.6 U/dl為G6PD基因初篩陽性。

1.2.3.2 G6PD生化檢查確診試驗 嚴格按照試劑盒說明書操作，使用G6PD/6GPD試劑盒，即日立7060生化儀對召回可疑病例進行生化檢查確診。結果判讀標準：G6PD/6GPD＜1為G6PD缺乏癥。

1.2.3.3 G6PD基因突變檢測 嚴格按照試劑盆說明書操作，找出確診為G6PD缺乏癥患兒的濾紙干血片，使用核酸提取儀Lab-Aid824提取干血片樣本中基因組DNA。然后用帶有FAM、HEX、ROX和Cy5檢測通道且具有熔解曲線分析功能的Bio-Rad CFX96型實時PCR擴增儀進行基因擴增和熔解曲線分析。按照試劑盒說明書上的結果判讀標準判斷是否發生突變及突變類型。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2017年度海南省全省新生兒G6PD缺乏癥初篩、確診情況 2017年度海南省全省新生兒G6PD缺乏癥初篩樣本中初篩陽性率為4.00%（5 221/130 512），G6PD/6GPD確診2 993例，經基因檢測該2 993例新生兒均有G6PD基因突變。海南省新生兒G6PD/6GPD確診G6PD缺乏癥發生率和G6PD基因突變率均為2.29%（2 993/130 512）（見表1）。

G6PD/6GPD確診G6PD缺乏癥發生率漢族為1.80%（1 972/109 590）， 黎 族 為 5.28%（934/17 698），其他民族為2.70%（87/3 224）。黎族G6PD缺乏癥發生率高于漢族，差異有統計學意義（χ2=826.206，P＜0.001）。

表1 2017年度海南省全省新生兒G6PD缺乏癥初篩情況及G6PD/6GPD確診人數Table 1 The first screening of neonatal G6PD deficiency and the number of G6PD/6GPD diagnosis in Hainan Province in 2017

2.2 2017年度海南省全省G6PD缺乏癥新生兒基因突變類型 本次共檢出10種基因突變類型：1 636例（54.66%）c.1376G＞T，659 例（22.02%）c.1388G＞A，254例（8.49%）c.95A＞G，204例（6.82%）c.1024C＞T，93 例（3.11%）c.871G＞A，64例（2.14%）c.519C＞T，25例（0.84%）c.392G＞T，22例（0.74%）c.1360C＞T，19例（0.63%）517T＞C，11例（0.37%）c.592C＞T，并檢出8例（0.27%）c.1376G＞T復合c.1388G＞A突變，3例（0.10%）c.1376G＞T復 合 c.871G＞A突 變，3例（0.10%）c.1376G＞T復合c.517T＞C突變。并發現5例（0.17%）未知突變，目前有3例經基因測序發現1例為 487G＞A、1例為 1004C＞A 和 1例為 c.86C＞T，另 2例因家屬和經費等原因未做測序檢測。

3 討論

G6PD缺乏癥是多民族的遺傳性疾病，是世界上最常見的酶缺乏癥[6]，WHO將其劃分為Ⅰ～Ⅴ共5個類別[7]，絕大多數缺陷個體屬重度缺陷（Ⅱ和Ⅲ類），雖然平素可無任何癥狀[8]，但是由于G6PD缺乏，紅細胞更容易受到食物和藥物引起的氧化應激的損傷，導致急性溶血性貧血[9]，若不能制止溶血和及時輸血，可發生死亡[10]。目前G6PD缺乏癥尚無有效的根治措施，但該病在中國熱帶、亞熱帶地區較為普遍，特別是海南省屬該病的高發地區[11]。因此在海南省新生兒期開展大規模的篩查和基因診斷，做到早發現早預防顯得尤為重要。

目前臨床上使用的G6PD基因檢測方法有等位基因特異性擴增、PCR-反向斑點雜交技術及基因測序技術、等位基因寡核苷酸探針雜交等[12]，但是以上方法受到操作高要求、試劑成本、儀器設備等因素的限制，而多色探針熒光PCR熔解曲線法是近年來興起的一種G6PD基因檢測手段，是2019年新發布的G6PD專家共識[5]推薦的基因檢測方法，該方法涵蓋了98.5%的中國人群常見的10種基因突變類型，又包含了6種較為少見的基因突變類型，在判斷基因位點突變的同時，因其標記不同顏色的生物素探針，可直接在PCR儀上分析結果，且試劑成本低、靈敏度高、特異性強[13]，已逐漸應用于臨床檢測當中，這也是本研究選用此方法的原因所在。

本研究統計分析發現，2017年度海南省全省新生兒G6PD基因突變以占54.66%的c.1376G＞T和占22.02%的c.1388G＞A為主，兩者合占總突變的76.68%，其余基因型均不足10%，這是中國人群最常見的G6PD基因突變基因型[14]。并且c.95A＞G和c.1024C＞T分別占總突變類型的8.49%、6.82%，說明這兩種也較為常見。2017年度海南省出生的新生兒可以視為海南省人口的代表，以上4種基因突變占總突變的91.99%，可以認為這是海南省人群G6PD基因突變的主要類別。本次共檢出10種基因突變類型，相較于其他研究[15-16]G6PD基因突變類型豐富。G6PD/6GPD確診的2 993例G6PD缺乏癥新生兒經基因檢測均有突變，海南省人群G6PD基因突變率約為2.29%，漢族為1.80%，黎族為5.28%，其他民族為2.70%。漢族和黎族G6PD基因突變有差異，黎族人群G6PD缺乏癥發生率顯著高于漢族，差異具有統計學意義，這說明了G6PD基因突變不但具有地域差異而且也有種族特點[17-18]。筆者認為海南省人群G6PD基因突變率會更高，原因如下：首先G6PD/6GPD對于女性雜合子的低檢出率，必然會造成女性雜合子的漏檢。另外地中海貧血患者會影響G6PD 活性增高已達成共識[19-20]，這必然使得GSP熒光分析法對新生兒G6PD的初篩受到影響，造成部分G6PD雜合子的漏檢，這也直接影響G6PD基因突變的檢出率。而海南省恰恰是地中海貧血高發地區，特別是黎族發病率更高[21]，由此推算海南省黎族新生兒G6PD基因突變率會高于本次得到的5.28%。G6PD基因全長20 kb，共編碼515個氨基酸[22]，從而導致突變的復雜性。本研究發現3種復合突變也證實了這一點：8例c.1376G＞T復合c.1388G＞A；3例c.1376G＞T復合c.871G＞A突變；3例c.1376G＞T復合c.517T＞C突變。PCR熔解曲線法可以檢測探針覆蓋區域的序列變異，因此本研究先后檢出了5例未知位點突變，其中3例經基因測序發現c.86C＞T、c.487G＞A和c.1004C＞A突變各有1例，各占總突變的0.03%，這3例基因突變類型在海南還未見報道。另外2例未知突變，限于家屬和經費等原因還未做測序。

綜上所述，海南省新生兒G6PD缺乏癥發生率較高，且基因突變類型豐富，特別是海南省特有少數民族——黎族的G6PD缺乏癥發生率顯著高于漢族。同時，G6PD缺乏癥基因突變類型主要以c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G和c.1024C＞T為主；且發現5例未知突變，其中c.86C＞T、c.487G＞A和c.1004C＞A突變各有1例，屬于海南省人群的首次報道。該結論有利于G6PD缺乏癥的防治，為后續基因突變導致的不同臨床表型研究奠定分子基礎。

作者貢獻：趙振東進行文章的構思與設計、數據收集與整理、統計學處理、論文修訂，對文章整體負責、監督管理；趙振東、王潔進行研究的實施與可行性分析、結果分析與解釋，撰寫論文；王潔負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。