錳摻雜硫化鋅量子點磷光探針對蜂蜜中四環素類抗生素殘留的高靈敏檢測

劉振平，姜 容，龐鈳靖

(重慶安全技術職業學院，重慶 404020)

1 引 言

四環素類抗生素(Tetracyclines，TCs)對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌、支原體、衣原體、立克次體和原蟲具有廣譜、高效的抗菌活性[1-3]。四環素類抗生素已廣泛應用于動物疾病的預防和治療，同時也有被用作生長促進劑的報道[4]。隨著集約養殖業的發展，細菌病害的頻繁爆發給人類造成了巨大的經濟損失，TCs可有效控制這些病害[1]。但是，TCs會對人體產生肝損傷、牙齒變黃和腸道菌群紊亂等副作用，日常的攝入還會增加微生物的耐藥性[5]。另外，在低濃度時，TCs可能會引起敏感個體的過敏反應[6]。因此，建立動物食品中TCs殘留的檢測方法對于保障食品安全具有重要意義。

近年來，研究人員開發了很多TCs及其類似物殘留的檢測方法，比如利用紫外高效液相色譜法、二極管陣列、熒光法、質譜分析法等對動物的肝、腎、脂肪、蛋、血漿和魚、蝦等進行TCs殘留定量分析[7-16]。這些方法雖然靈敏但存在成本高、操作復雜、檢測時間長、所用試劑有毒等問題，限制了實際應用。以熒光信號為基礎的熒光檢測方法已被證明是快速檢測目標的有效和可行的方法[17-20]。基于量子點(Quantum dots，QDs)的熒光或室溫磷光信號用于探針研究引起了廣泛關注[21]。與傳統有機染料相比，量子點具有激發光譜寬、連續、發光效率高、光化學穩定性高、光譜窄對稱、顏色可調等優點[22]，因此，也被廣泛應用于微生物、生物大分子、無機分子和金屬離子的定量檢測[23-27]。另外，由于壽命和發射波長較長，量子點的磷光特性在一定程度上優于熒光，可避免目標物自熒光發射和熒光散射光的干擾[28]。

內濾效應(Inner-filter effect，IFE)是目標物的吸收光譜與熒光或磷光物質的激發或發射光譜重疊時，當有目標物存在的情況下，激發或發射光被部分吸收而導致熒光或磷光猝滅的現象[29]。本研究利用TCs對錳摻雜硫化鋅量子點(Mn∶ZnS QDs)室溫磷光產生的內濾效應，以強力霉素(Doxycycline，DTC)為代表，建立了簡便、高效、低成本探針體系，實現了對蜂蜜中TCs殘留的定量檢測。

2 材料與方法

2.1 試劑

強力霉素，重慶葆光生物技術有限公司;Zn-SO4、NaOH、C2H5OH、MnCl2、Na2S·9H2O，成都市科龍化工試劑廠;L-半胱氨酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DTC陰性蜂蜜樣品，重慶蜂谷美地生態養蜂有限公司。

2.2 儀器與設備

TU-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;LS-55發光分光光度計，美國Perkin Elmer公司;KQ-700DB超聲設備，昆山市超聲儀器有限公司;pH-S20K pH計，瑞士Mettler Toledo公司;Tecnai F20透射電子顯微鏡，美國FEI公司;FLS920熒光壽命光譜儀，英國Edinburgh公司(Edinburgh analytical instrument FLS920 fluorescence spectrometer);Bruker vetex70傅里葉紅外光譜儀，德國 Bruker公司;Zeta Sizer Nano ZS90粒徑及Zeta電位分析儀，英國Malvern公司;超純水系統，重慶摩爾水處理設備有限公司。

2.3 試驗方法

2.3.1 原理

基于內濾效應的Mn∶ZnS QDs磷光探針對DTC的高靈敏檢測原理如圖1所示。L-半胱氨酸修飾的Mn∶ZnS QDs在289 nm波長的激發光作用下，在583 nm處發射磷光，目標物DTC的紫外吸收光譜與Mn∶ZnS QDs的磷光激發光譜存在較大程度重疊，因此，當Mn∶ZnS QDs體系中存在DTC時，部分激發光被DTC吸收，導致Mn∶ZnS QDs磷光發射強度降低，進而建立DTC濃度與磷光信號的線性關系，實現對DTC的快速定量檢測。

2.3.2 Mn∶ZnS QDs的合成

為增加Mn∶ZnS QDs的水溶性，以L-半胱氨酸作為穩定劑，合成方法在參考文獻[30]的基礎上進行了部分優化:50 mL 0.03 mol·L-1-半胱氨酸與5 mL 0.1 mol·L-1ZnSO4混合于三口燒瓶中，用2 mol·L-1NaOH溶液將混合溶液pH調整為11，通氮氣室溫攪拌1 h后，隔絕空氣注射1.4 mL 0.01 mol·L-1MnCl2繼續攪拌30 min，5 mL 0.1 mol·L-1Na2S 快速注入溶液中繼續攪拌30 min后，放入50℃水浴中在空氣中陳化3.5 h。用等體積的無水乙醇離心分離(10 000 r/min，20 min)，乙醇洗滌兩次后沉淀物真空干燥即得L-半胱氨酸作為穩定劑的Mn∶ZnS QDs粉末，備用。

圖1 基于內濾效應的Mn∶ZnS QDs磷光探針檢測強力霉素原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of DTC detected principle for Mn∶ZnS QDs phosphorescence probe based on IFE

2.3.3 試驗條件優化

Mn∶ZnS QDs濃度的選擇:根據 LS-55分光光度計的量程和Mn∶ZnS QDs磷光強度，經過反復實驗確定最終體系中Mn∶ZnS QDs濃度為0.1 mg·mL-1。

探針體系 pH的確定:根據 pH對 Mn∶ZnS QDs磷光強度的影響，選擇磷光最強時的pH作為體系最終pH。

2.3.4 DTC檢測

精確稱取一定量的Mn∶ZnS QDs粉末超聲分散在pH=9的PBS中，配制成0.3 mg·mL-1Mn∶ZnS QDs溶液，取1 mL上述溶液，加入不同濃度的DTC溶液后用pH=9的PBS稀釋至3.0 mL，分別配制成含有 DTC 0.05，0.25，1，2.5，5，10，25，50，100，150 μmol·L-1的標準溶液。將 L-55型分光光度計設置為磷光模式，在289 nm激發波長下測量583 nm處的磷光強度。

2.3.5 選擇性試驗

按照2.3.4的方法分別測定最終濃度為25 μmol·L-1的四環素、鏈霉素、卡那霉素、克林霉素和呋喃西林溶液，重復3次，結果與空白對比。

2.3.6 實際樣品處理

本研究以蜂蜜為檢測對象來測試基于Mn∶ZnS QDs磷光探針對實際樣品檢測的實用性。DTC與較多金屬離子如Cu2+、Al3+、Mg2+等有較強的螯合作用，為避免金屬離子的干擾，本研究參考已報道的檢測蜂蜜中四環素的樣品前處理方法對樣品進行處理[31-32]。具體步驟為:5 g蜂蜜樣品加入一定量的DTC標準溶液后與20 mL McIL-vaine-Na2EDTA緩沖溶液(M-E，檸檬酸12.93 g，37.33 g Na2EDTA，22.38 g Na2HPO4·12H2O 配成1 L溶液，pH=4.0)混合，加入5 mL 5%的三氯乙酸，旋渦混合5 min，超聲5 min，4℃ 下4 000 r/min離心20 min，取上清液用pH=4的NaOH調節pH=9，避光4℃儲存，使用前用5倍10 mmol·L-1Tris-HCl(pH=9)稀釋，配制成含DTC最終濃度分別為 0.5，5，20，60，120 μmol·L-1的蜂蜜樣品。

2.4 數據分析

利用Microsoft Office Excel 2010對實驗所得數據進行基本處理，采用OriginPro 8.5作圖和線性分析。

3 結果與討論

3.1 Mn∶ZnS QDs的表征

分別通過透射電鏡、傅立葉變換紅外光譜和磷光光譜對合成的以L-半胱氨酸為穩定劑的Mn∶ZnS QDs進行表征。如圖2所示為Mn∶ZnS QDs的透射電鏡圖像，經過計算其平均粒徑為3.8 nm，與文獻報道相符[33]。在L-半胱氨酸修飾的Mn∶ZnS QDs紅外光譜圖(圖3)中可以看出，3 468 cm-1處為羧基中羥基的伸縮振動峰，3 331 cm-1和3 269 cm-1處是氨基的特征吸收峰，1 602 cm-1處出現的吸收峰為N―C伸縮振動峰，1 128 cm-1處的強吸收峰由羧基中的羰基產生，但是2 600 cm-1處的巰基振動峰消失了，這是由于巰基在內部與量子點結合的緣故[34]。上述結果表明，L-半胱氨酸已鍵合在Mn∶ZnS QDs表面。從 Mn∶ZnS QDs的磷光光譜圖(圖4)中可以看出，在289 nm的激發光作用下，Mn∶ZnS QDs在583 nm處發出較強的磷光。

圖2 Mn∶ZnS QDs透射電鏡圖像，嵌圖為粒徑分布圖。Fig.2 TEM image of Mn∶ZnS QDs，the illustration is a particle size distribution.

圖3 L-半胱氨酸修飾的Mn∶ZnS QDs紅外光譜Fig.3 FT-IR spectra of Mn∶ZnS QDs modificated by L-cysteine

圖4 L-半胱氨酸修飾的Mn∶ZnS QDs磷光光譜Fig.4 Excitation and emission phosphorescence spectra of Mn∶ZnS QDs

3.2 磷光猝滅機理分析

圖5 不同濃度DTC紫外吸收光譜Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of different concentrations of DTC

圖6 Mn∶ZnS QDs磷光激發光譜和DTC紫外吸收光譜Fig.6 Excitation spectra of Mn∶ZnS QDs and DTC ultraviolet absorption spectra

如圖 5 所示，濃度分別為 8，12，25，50，75 μmol·L-1DTC的紫外吸收光譜，在289 nm處的吸光度隨濃度的增大而增強。從圖6可以看出，DTC的紫外吸收光譜和Mn∶ZnS QDs磷光激發光譜圖存在較大程度的重疊，同時根據朗伯比爾定律計算得到DTC在最大紫外吸收波長處的吸光系數為1.35×104。向Mn∶ZnS QDs體系溶液中加入一定濃度的DTC時，Mn∶ZnS QDs的磷光信號會出現一定程度的猝滅，且隨著DTC濃度的增大磷光信號猝滅程度也隨之增大(圖7)。一般地，磷光壽命可以代表物質的激發態信息，因此確定磷光壽命對于研究能量轉移或電子轉移引起的磷光猝滅具有重要意義[33]。如圖8所示，對在最大激發波長下測試的磷光壽命曲線進行擬合后得到Mn∶ZnS QDs中加入DTC前后的磷光壽命分別是2.399 ms和2.062 ms，未發生明顯變化，表明DTC對量子點的猝滅效應不是基于Mn∶ZnS QDs和DTC之間的能量轉移。如圖9所示，左縱軸為25 μm DTC的紫外吸收光譜，右縱軸各點表示在對應波長的光作為激發光時 DTC(25 μmol·L-1)對Mn∶ZnS QDs磷光的猝滅程度，即P0-P(P0為猝滅前的磷光強度，P為體系存在DTC時的磷光強度)，猝滅效應隨激發波長的變化而變化，在 DTC的最大紫外吸收波長處猝滅效果最強。另外，本研究還對Mn∶ZnS QDs、DTC及其混合物的Zeta電位進行了測量，分別為-30.7，-28.3，-29.1 mV，說明 Mn∶ZnS QDs和 DTC 均帶負電不存在相互吸引的靜電作用。以上結果表明，DTC對Mn∶ZnS QDs磷光的猝滅機理是內濾效應。

圖7 Mn∶ZnS QDs磷光信號強度隨DTC濃度增大而降低Fig.7 Signal strength of Mn∶ZnS QDs decreases with the increase of the DTC concentration

圖8 Mn∶ZnS QDs和Mn∶ZnS QDs+DTC磷光壽命曲線Fig.8 Phosphorescence lifetime curve of Mn∶ZnS QDs solution and Mn∶ZnS QDs+DTC solution

圖9 Mn∶ZnS QDs(25 μmol·L-1DTC)磷光猝滅程度與DTC紫外吸收光譜的關系Fig.9 Comparison of absorbance of DTC and the excitation wavelength-dependent phosphorescence quenching of Mn∶ZnS QDs in the presence of 25 μmol·L-1DTC

3.3 探針體系pH優化結果

通過實驗發現，Mn∶ZnS QDs的磷光信號受pH影響較大，如圖10所示，Mn∶ZnS QDs在酸性條件下磷光強度低的原因可能與量子點和穩定劑的解離有關;隨著pH逐漸增大穩定劑與量子點的共價鍵作用逐漸增強，表現為磷光強度不斷增大，且在pH=9～11范圍內具有較強磷光信號且相對穩定。同時測試了DTC穩定性受pH的影響，隨著pH逐漸增大，DTC的紫外吸光度無顯著變化。綜合以上結果，本研究選擇9作為體系的pH值。

圖10 pH對Mn∶ZnS QDs磷光強度和DTC紫外吸光度的影響Fig.10 Effect of pH on phosphorescence intensity of Mn∶ZnS QDs and UV absorbance of DTC

3.4 DTC的定量檢測

在優化的實驗條件下，本研究建立磷光探針對 DTC 濃度梯度為 0.05，0.25，2.5，25，50，100，150 μmol·L-1的標準品進行了測定。如圖11所示，隨著DTC濃度的不斷增大，Mn∶ZnS QDs磷光信號不斷減弱。DTC 在0.05～150 μmol·L-1濃度范圍內與Mn∶ZnS QDs磷光猝滅前后比值的自然對數[ln(P0/P)]呈良好的線性關系，線性方程為lnP0/P=0.01758C(DTC)+0.01351，相關系數 R2=0.999，檢出限為 0.009 7 μmol·L-1(信噪比為3(S/N=3))。該磷光探針與其他文獻報道的DTC檢測法相比，有較低的檢測限和較寬的檢測范圍(見表1)。此外，將制備好的Mn∶ZnS QDs磷光探針體系置于4℃ 條件下避光保存，在最優實驗條件下，每隔一天對濃度為25 μmol·L-1的DTC進行檢測，用來檢驗該探針的穩定性。在25 μmol·L-1的DTC條件下，紫外吸收測定結果的日內精密度為3.34%，日間精密度為4.15%。上述結果表明，放置一段時間的探針體系檢測效果與制備初期檢測效果差異不大，具有良好的穩定性(7 d)。

圖11 不同DTC濃度對Mn∶ZnS QDs磷光強度的影響Fig.11 Effect of DTC concentration on phosphorescence intensity of Mn∶ZnS QDs

表1 本研究磷光探針與其他方法比較Tab.1 Comparison with other detection methods

3.5 選擇性試驗

圖12 磷光探針選擇性分析Fig.12 Selectivity analysis of phosphorescence probe

為驗證本研究磷光探針的選擇性，排除實際樣品檢測中可能遇到的其他族類或結構類似抗生素的干擾，分別加入25 μmol·L-1的四環素、鏈霉素、卡那霉素、克林霉素和呋喃西林進行磷光信號測定，結果如圖12所示。與空白對照，當檢測體系中存在25 μmol·L-1DTC或四環素時，磷光信號明顯降低，但是當檢測體系中的DTC或四環素由其他抗生素替代時，磷光信號無明顯變化。

3.6 蜂蜜樣品檢測結果

取適量DTC陰性蜂蜜樣品，按照2.3.6方法進行加標回收實驗，每個樣品平行測定3次，以實際測得的DTC濃度與添加的DTC濃度的比值來計算加標回收率，所得加標回收率為92.4%～110%，RSD均小于4.15%(n=3)。結果表明，該磷光探針準確可靠，可用于實際蜂蜜樣品中DTC含量的測定(見表2)。

表2 蜂蜜樣品中DTC的檢測Tab.2 Detection for DTC in honey samples

4 結 論

本研究以TCs對Mn∶ZnS QDs磷光的內濾效應為基礎，以DTC為代表構建了用于檢測蜂蜜中TCs殘留的磷光探針，所需設備簡單，操作簡便，成本低，效率高，在pH=9的PBS溶液中簡單地將Mn∶ZnS QDs目標物混合在一起，就可以得到檢測結果，并且具有較高靈敏性。在優化的實驗條件下，DTC 在 0.05 ～150 μmol·L-1濃度范圍內與Mn∶ZnS QDs磷光猝滅前后比值的自然對數[ln(P0/P)]呈良好的線性關系，線性方程為lnP0/P=0.01758C(DTC)+0.01351，相關系數R2=0.999，檢出限為 0.009 7 μmol·L-1。同時，對實際樣品蜂蜜做了加標回收率實驗，回收率為92.4%～110%。由于DTC與四環素同屬于四環素類抗生素，它們具有相似的結構和性質，通過對四環素、土霉素和金霉素的紫外吸收光譜的掃描發現四種四環素類抗生素具有相似的紫外吸收光譜和吸光系數，因此，可對本研究建立的磷光探針在蜂蜜中四環素類抗生素殘留總量的定量分析做進一步研究。另外，從本研究基于內濾效應的磷光猝滅機理分析可以看出，如果被測樣品溶液中含有在225～325 nm具有較強的紫外光吸收物質時，即可對本磷光探針產生干擾，因此該探針在直接用于復雜基質樣品的測定時存在一定局限性。但是，根據被測樣品的特點，結合相應分離技術，也可實現除蜂蜜外的其他動物性食品和環境分析中強力霉素殘留的快速高靈敏檢測。