云南省永德縣豬偽狂犬病血清學調查

呂 濤 舒相華,2 羅班乾 趙金明 彥洪奎 宋春蓮*

（1云南農業大學動物醫學院，云南昆明 650201；2昆明偉牧得生物科技有限公司，云南昆明 650201；3云南省永德縣畜牧獸醫局，云南永德 677600）

豬偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，可造成公豬的睪丸出現萎縮或腫脹、未妊娠母豬出現配種不孕，妊娠母豬多表現為流產、產死胎等[1]；新生仔豬感染PRV后，通常表現口吐白沫、角弓反張等不同的神經癥狀，嗜睡、鳴叫、嘔吐、拉稀，1～2 d內死亡，發病率和死亡率可達到100%[2]；育肥豬感染的潛伏期為3～5 d，表現為慢性呼吸道癥狀、增重遲緩、飼料報酬降低、上市時間推遲[3]，育肥豬呼吸困難、生長停滯等[4]。PRV屬于DNA病毒，皰疹病毒屬，其主要存活于腦和脊髓中[5]，可在豬體內建立潛伏感染，其宿主范圍很廣，豬是其自然宿主和傳染源之一[6]，病毒在豬體內可以長期潛伏存在，可持續帶毒1年以上[7]。PRV主要通過公豬精液、母豬胎盤傳播，亦可以水平傳播[8]，攜帶PRV的貓、鼠、犬、豬等動物可通過唾液、汗液、乳液等分泌物持續向外散毒，病毒在體外通過飼料、尿液、水等途徑傳播擴散[9]。本病一年四季都可發生，但以冬春兩季和產仔旺季多發[10]。

近年來，偽狂犬病感染率呈現出上升的趨勢，嚴重阻礙了養豬業的健康發展，使養殖者蒙受巨大的經濟損失[11]。為了解云南省永德縣規模化養豬場豬偽狂犬病感染和疫苗免疫情況，本試驗用PCR檢測方法和ELISA檢測方法對云南省永德縣豬偽狂犬病在種豬之間的流行情況進行調查研究，為全縣豬偽狂犬病凈化提供數據支持。

1 材料

1.1 樣品來源

云南省永德縣2個鄉鎮229頭種母豬，前腔靜脈采血5 mL，離心后取上層血清。30頭公豬采集精液原液5 mL，置于－4℃保存，備用。

1.2 主要儀器

單道和8道可調移液器；電熱恒溫箱（型號：DHG－9240A）；離心機（型號：TDL－40F），購自無錫市瑞江分析儀器有限公司；酶標儀（型號：DWB－96G），購自廣州泰思儀器設備有限公司；PCR擴增儀（型號：846-X-070-301），購自德國耶拿分析儀器股份公司；電泳儀（型號：BAYGENE），購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統（型號：WD-94213B）等。

1.3 主要試劑

⑴豬偽狂犬病感染抗體和免疫抗體ELISA檢測試劑盒（生產批號：190504），購自無錫優聯生物科技有限公司；病毒核酸提取試劑盒（生產批號：020181108），購自北京擎科生物科技有限公司。

⑵引物參照GenBank中PRV MinA株gE基因序列（Accession No.：AY170318），采用 Primer 5.0軟件設計了1對檢測引物。P1：5′-TCGGACAGGAAGGACACCAT-3′，P2：5′-CTACGAGGACTACAACTACG-3′。

2 方法

2.1 PCR抗原檢測方法

⑴病毒核酸提取方法參考北京擎科生物科技有限公司生產的動物基因組提取試劑盒說明書；檢測了30頭公豬精液的PRV抗原。

⑵PCR擴增及鑒定。PCR擴增體系為：Premix Taq（ TaKaRaTaq Version 2.0plusdye） 12.5 μL、Sterilized ddH2O10.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA 1 μL。PCR反應條件為：98℃預變性 5 min；94℃50 s，61℃50 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min，產物4℃保存。

⑶瓊脂凝膠電泳。稱取瓊脂粉0.5 g，溶于50 mL蒸餾水中，配成濃度為1%的瓊脂糖凝膠。

2.2 ELISA抗體檢測方法

采用ELISA法檢測母豬的血清疫苗抗體和野毒抗體，嚴格按照試劑盒操作說明書進行，主要步驟為設置陰性、陽性、空白對照，稀釋，加樣，溫育，洗板，加酶標底物，再洗板，顯色，終止反應。使用進口IDEXX公司的試劑盒在酶標儀上650 nm波長處測定各孔的OD值。試驗成立條件：陰性對照平均OD值－陽性對照平均OD值≥0.4，用S（樣品孔OD值）/N（陰性對照平均OD值）值來判定檢測結果，若S/N值≤0.6，樣品判為陽性；若0.6＜S/N值≤0.7，樣品判為可疑，需重新測定；若S/N值＞0.7，樣品判為陰性。

3 結果與分析

3.1 抗原PCR檢測結果

對永德縣2個鄉鎮部分供精站30頭種公豬精液進行PCR抗原檢測，電泳結果顯示30份核酸樣品PRV抗原均為陰性；說明30頭種公豬未感染PRV。見圖1。

3.2 免疫抗體與感染抗體檢測結果

母豬PRV gB-ELISA即免疫抗體陽性率為57.89%，gE-ELISA即感染抗體陽性率為3.10%，總體結果表明免疫保護率較低，野毒感染率較低。見表1。

表1 PRV gB、gE抗體檢測結果

4 討論

⑴根據PCR檢測抗原結果，試驗的30頭種公豬均未感染PRV，這可能與永德縣四面環山的特殊地理環境所形成的天然屏障保護的作用有關，田輝等[12]發現秦嶺對冬夏季風的屏障作用引起的氣候差異，是導致秦嶺南北手足口病流行特征不同的主要因素。夏爐明等[13]對上海市規模豬場豬偽狂犬病傳播風險因素的調查結果發現，“1年內引進種豬”“引進公豬精液”是導致PRV場間傳播的主要危害性因素之一，“引種/引進精液時檢測PRV gE抗體”為主要保護性因素。因此建議利用好該縣地理位置的優勢，采用自繁自養的養殖方式更有利于偽狂犬病的防控凈化。

⑵永德縣PRV gB免疫抗體陽性率為57.89%，低于謝相悅等[14]研究的云南省昌寧縣種母豬的PRV免疫抗體陽性率（80.30%），也低于彭澤琴等[15]報道的臨滄地區規模化豬場和散養戶的PRV免疫抗體陽性率（73.16%）。當免疫抗體陽性率低時，說明疫苗保護力差，豬只對PRV的抵抗能力弱，若PRV侵入將會給當地養殖戶造成巨大的經濟損失。PRV感染抗體陽性率為3.10%，低于畢峻龍等[16]對2009—2013年云南省楚雄地區豬偽狂犬病野毒感染的調查結果（感染抗體陽性率31.70%），低于謝香悅等[14]對云南省昌寧縣種母豬PRV野毒感染的調查結果（感染抗體陽性率為4.84%）；與吳程華等[17]對云南省楚雄地區散養戶154頭豬血清進行PRV野毒感染的調查結果（gE感染抗體陽性率為25.32%）相比較低。

與云南省不同地區的豬群豬偽狂犬病調查結果相比較，PRV免疫抗體陽性率低于楚雄、臨滄、昌寧等地區，感染抗體陽性率低于楚雄、昌寧等地區。分析原因可能是由于當地防疫意識比較薄弱，對豬偽狂犬病疫苗接種力度不夠。

⑶永德縣豬偽狂犬病野毒感染陽性率處在較低水平，利于豬偽狂犬病的防控凈化。因此要消滅傳染源，有效防控本病。第一，要嚴格做好種豬監測，不引進帶毒種豬，并淘汰本場帶毒豬；第二，要對發病豬場的病死動物尸體、死胎、流產物和其他污染物、排泄物銷毀，做無害化處理，同時加強衛生消毒[19]。

5 結論

云南省永德縣2019年豬偽狂犬病調查表明，豬偽狂犬病疫苗免疫保護力較低，應加強疫病監測和疫苗免疫；野毒感染陽性率較低，有利于實施豬偽狂犬病凈化，定期檢測種公豬，嚴格淘汰陽性豬，為永德縣豬偽狂犬病凈化打下堅實基礎。