氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對小鼠急性肝損傷的代謝物及相關(guān)代謝通路的研究*

馬小芬，蘇比努爾·巴克，李珍，李德龍，馬曉麗

（新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

急性肝損傷是引起肝硬化、肝癌的重要因素[1]，四氯化碳CCl4誘導(dǎo)的肝損傷是經(jīng)典的肝損傷模型之一[2-5],其損傷肝細(xì)胞的主要機(jī)制是通過強(qiáng)氧化性自由基及脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，造成肝臟組織損傷[6]。如何從代謝組學(xué)角度研究CCl4導(dǎo)致急性肝損傷的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)致毒標(biāo)志物將有助于對這一經(jīng)典肝毒性物質(zhì)的中毒機(jī)制的認(rèn)識。

目前，基于高分辨核磁共振[7]（nuclear magnetic resonance, NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）等[9]代謝組學(xué)分析技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于標(biāo)志物的篩查和分析[10]及疾病診斷、毒理學(xué)研究、新藥研發(fā)與藥物篩選等[11]，其中GC-MS 被認(rèn)為是分析組織代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一[12]。本文應(yīng)用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)探尋CCl4致小鼠急性肝損傷的肝組織代謝標(biāo)志物；運(yùn)用Metabo Analyst 3.0 在線代謝組分析工具進(jìn)行基于偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis, PLS-DA）的代謝物查找及代謝通路分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器GC-MS聯(lián)用儀（GC：waters, MS：Agilent 7683B series）、可視氮吹儀、KQ-500DE 型超聲儀（昆山超聲儀器有限公司），HH-S4恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），低溫離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司），HV-3 靜音無油空壓機(jī)（濟(jì)南浩偉實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.1.2 試劑 甲氧胺鹽酸鹽、N-甲基-（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺（MSTFA）、三甲基一氯硅烷（TMCS）、分析純、十七烷酸（美國Sigma 公司），甲醇、乙腈（美國Fisher chemicals 公司），色譜純、吡啶（天津大茂化學(xué)試劑廠，生產(chǎn)批號：20150612），分析純、實(shí)驗(yàn)用水取自新疆醫(yī)科大學(xué)超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF 級雄性昆明種小鼠，體重（20.0±2.0）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，所有動(dòng)物飼養(yǎng)按照國家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)定執(zhí)行。將適宜喂養(yǎng)的22 只小鼠隨機(jī)分為對照組和模型組，每組11 只。對照組和模型組小鼠適應(yīng)性灌胃生理鹽水0.5 ml 3 d 后，模型組腹腔注射0.1% CCl4橄欖油溶液10 ml/kg，對照組腹腔注射生理鹽水橄欖油溶液10 ml/kg。小鼠于模型復(fù)制后禁食不禁水12 h，立即斷頸處死，快速取出 完整肝臟，生理鹽水洗盡殘血，除去結(jié)締組織，濾紙拭干，稱重；準(zhǔn)確稱取0.50 g 肝臟，按1 ∶9（g ∶ml）加入冰生理鹽水，冰浴下手動(dòng)勻漿，4 000 r/min 離心5 min，分離得到10%肝勻漿上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肝組織病理切片

取小鼠左葉相同位置肝組織，用4℃生理鹽水沖盡殘血，濾紙拭干，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4 GC-MS 代謝組學(xué)分析

1.4.1 樣品前處理 參考文獻(xiàn)[13-14]將置于-80℃冷凍保存的樣品復(fù)溶后取100 μl 置于2 ml EP 管內(nèi)，加入250 μl 乙腈溶液混勻，渦旋1.5 min，冰浴超聲10 min，4℃、10 000 r/min 離心10 min 后，取上清液置于2 ml EP 管內(nèi)用氮吹干。加15 g/L 甲氧胺吡啶溶液50 μl 混勻，70℃下肟化1 h 后加入衍生化試劑（MSTFA ∶TMCS=100 ∶1）50 μl 混勻，靜止。1 h后加含十七烷酸的乙腈溶液（0.9 mg/ml）150 μl 混勻，4℃、10 000 r/min 離心10 min，取上清液于內(nèi)插管內(nèi)置于微量進(jìn)樣瓶待測。

1.4.2 GC-MS 條件 升溫程序?yàn)椋?5℃保持5 min后，以10℃/min 上升至300℃，保持10 min；進(jìn)樣量：2 μl，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：270℃；接口溫度：270℃；離子源溫度：230℃；電離電壓：70 eV；四極桿溫度：150℃；載氣：高純氦氣，1.0 ml/min；掃描方式：全掃描60～600 m/z。每次進(jìn)樣時(shí)均用甲醇和乙腈清洗進(jìn)樣針各4 次，避免前一次樣品影響結(jié)果。

1.4.3 GC-MS 圖譜數(shù)據(jù)處理 GC-MS 的總粒子流圖（TIC）中共有的峰和具有代表性的峰被提取出來，并對所有的峰進(jìn)行手動(dòng)峰面積積分，獲取各個(gè)峰與內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間及峰面積導(dǎo)入Excel 表內(nèi)備用，用樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰的比值（相對峰面積）表示代謝物的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 和Metabo Analyst 3.0 統(tǒng)計(jì)軟件，對歸一化后峰面積相對值導(dǎo)入SIMCA-P12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行PLS-DA 分析[15]，最大化地顯示出組間的差異。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用PLS-DA 模型中變量重要性投影（variable importance in the projection, VIP）和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來共同評價(jià)可能的內(nèi)源性代謝物相對峰面積的差異，只有同時(shí)滿足VIP＞1 和P＜0.05 的代謝物才被認(rèn)為是潛在生物學(xué)標(biāo)志物[16-17]。

2 結(jié)果

2.1 CCl4 急性肝損傷模型病理變化

對照組小鼠肝組織病理切片與模型組比較，模型組小鼠的肝細(xì)胞排列紊亂，部分肝細(xì)胞內(nèi)見大小不等的脂滴空泡，另有部分區(qū)域小葉內(nèi)肝細(xì)胞點(diǎn)狀、灶狀滑絲，伴有碎片狀肝細(xì)胞浸潤，肝中央靜脈及肝血竇充血，壞死灶區(qū)有較多淋巴細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.2 GC-MS 結(jié)果

2.2.1 NIST 圖譜中各代謝物圖譜 通過XCMS Online 軟件進(jìn)行肝組織樣品數(shù)據(jù)采集，得到各組典型TIC，通過TIC 中提取的峰面積一一在NIST 譜庫中進(jìn)行對比找到33 種共有代謝物質(zhì)，通過參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行查詢比對出14 種可能的內(nèi)源性代謝物。見圖2。

2.2.2 PLS-DA 結(jié)果 歸一化后峰面積相對值的PLS-DA 分析結(jié)果見圖3，可看出模型組各小鼠間比較分散，這可能是模型復(fù)制后個(gè)體差異造成的。3D圖中對照組與模型組兩組間有差異，且具有明顯的聚類特征。表明小鼠肝組織的生理環(huán)境及物質(zhì)代謝發(fā)生變化可能是CCl4致肝損傷[19]。

圖1 CCl4 誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織的組織病理學(xué)觀察 （HE×400）

圖2 GC-MS 各代謝物質(zhì)譜圖譜

2.2.3 差異性代謝物及潛在生物學(xué)標(biāo)志物 根據(jù)對照組和模型組內(nèi)源性代謝物相對峰面積的差異，分析發(fā)現(xiàn)5 種可能的差異性代謝物（P＜0.05），包括葡萄糖醛酰胺、D-酪氨酸、腺嘌呤、D-葡萄糖和麥角固醇。由表中的VIP＞1 同時(shí)結(jié)合t檢驗(yàn)結(jié)果可以說明這5種代謝差異物是CCl4肝損傷的可能潛在代謝標(biāo)志物。見表1。

2.2.4 通路分析 將10個(gè)通過模式識別篩選出的差異代謝物導(dǎo)入Metabo Analyst 3.0 網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路分析。可知CCl4模型復(fù)制后主要對機(jī)體的甲硫氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、嘌呤代謝等代謝通路產(chǎn)生影響。見 圖4。

圖3 兩組小鼠肝組織樣品3D PLS-DA 得分圖

表1 與CCl4 誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷相關(guān)的差異代謝物

圖4 兩組差異代謝物引起的代謝通路變化

3 討論

本研究采用GC-MS 技術(shù)對CCl4所致急性肝損傷小鼠進(jìn)行肝組織的代謝組學(xué)研究。采用PLS-DA 等多元分析模式識別方法及傳統(tǒng)的SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析，共篩選出5個(gè)生物標(biāo)志物，分別是葡萄糖醛酰胺、D-酪氨酸、腺嘌呤、D-葡萄糖、麥角固醇。經(jīng)Metabo Analyst 3.0 數(shù)據(jù)分析，CCl4所致急性肝損傷小鼠主要對機(jī)體的甲硫氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、嘌呤代謝等代謝通路產(chǎn)生影響。

CCl4是一種經(jīng)典的肝毒藥物，從代謝組學(xué)角度找出一些具有特異性變化規(guī)律的代謝物，全面揭示其生物效應(yīng)。小鼠經(jīng)CCl4模型復(fù)制后，肝組織切片表明其肝細(xì)胞明顯壞死，表明小鼠肝組織的生理環(huán)境及物質(zhì)代謝發(fā)生變化可能是CCl4致肝損傷[19]。對肝臟組織中的代謝物查找發(fā)現(xiàn)其肝臟組織損傷主要表現(xiàn)在能量供給阻礙，以及氨基酸代謝紊亂，小鼠肝細(xì)胞循環(huán)受到抑制，并且由于脂蛋白合成受阻,是脂肪酸從肝臟到血漿的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)能明顯下降。特別是肝組織中酪氨酸物質(zhì)含量下降，這種結(jié)果很可能是由于氨基酸在肝臟的轉(zhuǎn)運(yùn)受到阻礙，因此其相互轉(zhuǎn)化受阻，其直接的表現(xiàn)為參與機(jī)體能量代謝的相關(guān)通路和循環(huán)比如苯丙氨酸代謝通路及三羧酸循環(huán)受到抑制，進(jìn)而引發(fā)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，最終表現(xiàn)出肝衰竭的相應(yīng) 表征。

苯丙酸屬于芳香族氨基酸是苯丙酮酸和酪氨酸的主要合成原料，均在苯丙氨酸代謝通路中有著重要作用，機(jī)體內(nèi)酪氨酸的含量會(huì)引起某些代謝中間產(chǎn)物的變化而導(dǎo)致肝功能損傷或腎小管缺陷。甲硫氨酸是含硫必需氨基酸，機(jī)體內(nèi)甲硫氨酸不足會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受到影響，進(jìn)而引起肝功能障礙。YADAK等[20]研究發(fā)現(xiàn)嘌呤脫氧核苷可導(dǎo)致肝臟發(fā)生毒性，嘌呤脫氧核苷在機(jī)體內(nèi)的變化最終體現(xiàn)在嘌呤代謝通路中。本研究中小鼠肝組織酪氨酸物質(zhì)含量下降及嘌呤代謝物變化可能與代謝通路間密切相關(guān)，但具體影響急性肝損傷嘌呤代謝通路的物質(zhì)并不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

本研究成功地將代謝組學(xué)分析方法引入急性肝損傷的研究中，并通過在線數(shù)據(jù)庫分析影響肝臟病理變化的相關(guān)代謝通路，為深入探討急性肝損傷模型的作用機(jī)制奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。