心臟不停跳大鼠單肺體外循環肺損傷模型的建立

劉科宇，張紅，何苗，謝菲，李倩，于承坤

（1.遵義醫科大學 麻醉醫學院，貴州 遵義 563000；2.成都大學附屬醫院 麻醉科，四川 成都 610081；3.遵義市第一人民醫院 重癥醫學科，貴州 遵義 563000）

目前體外循環（cardiopulmonary bypass, CPB）技術已廣泛應用于臨床心血管手術和非心血管手術中，但CPB 后各重要臟器的病理生理改變，一直是人們關注的重點。為進一步研究相關保護措施，國內外已經復制了多種CPB 動物模型，如：猴[1]、豬[2]、狗[3]等。因大鼠基因與人同源程度高、個體差異小、可重復性強，價格低廉、品系純正，同時大鼠體型小，適合單人操作，使實驗操作差異性明顯減小[4]，所以大鼠CPB 模型越來越受到科研人員的重視，但目前針對CPB 肺損傷及肺保護的大鼠CPB 模型還鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD 大鼠24 只。雄性，體重350～500g，4～8個月，清潔級，由陸軍軍醫大學大坪醫院創傷外科研究所動物中心提供，許可證號：SCXK（渝）2012—0005。術前禁食12h，禁水2h。

1.2 實驗設備

大鼠膜式氧合器（東莞科威醫療機械有限公司），小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司），BT100-2J 蠕動泵（蘭格恒流泵有限公司），大鼠體溫維持儀（瑞沃德生命科技有限公司），MD3000 型生物信號采集處理系統（淮北正華生物儀器設備有限公司），GEM Premier 3000 血氣分析儀（美國實驗儀器公司），ACT 儀（美國美敦力公司），WZS-50F2 雙通道輸液泵（浙江大學醫學儀器有限公司），16、20 及22G 靜脈留置針（貝朗醫療上海國際貿易公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 CPB 管道的準備 CPB 管道由儲血室（20ml注射器）、大鼠膜肺、蠕動泵、硅膠管（外徑約4mm，內徑約3mm，長為60cm）以及動靜脈管路組成。動物實驗前，連接CPB 管道，連接氧氣源，用羥乙基淀粉9ml、甘露醇1ml、鈉鉀鎂鈣葡萄糖注射液1ml及5%碳酸氫鈉1ml 預充CPB 管道，排凈空氣。

1.3.2 實驗分組 將24 只大鼠隨機分為單純開胸組（T 組）、單純CPB 組（C 組）、缺血再灌注組（IR 組），每組8 只。T 組僅開胸，C 組開胸后僅建立CPB 模型，IR 組開胸后建立大鼠CPB 左肺缺血再灌注損傷模型。

1.3.3 模型的建立 采用1%戊巴比妥鈉（腹腔內注射，50mg/kg）麻醉大鼠。麻醉后仰臥位固定大鼠，行尾靜脈穿刺置管。用加熱毯給大鼠保溫。喉鏡明視下行氣管插管，氣管導管連接小動物呼吸機，并行機械通氣，維持潮氣量15ml/kg，呼吸頻率60 次/min，I ∶E=1.0 ∶2.5，FiO2∶99%。分離右側股動靜脈及左側股靜脈并穿刺置管，右側股動脈連接生物信號采集處理系統監測大鼠心率和血壓。將體溫計插入大鼠肛門5mm 處以檢測核心溫度。尾靜脈注射肝素 5mg/kg，待全身肝素化后，以雙側股靜脈作為靜脈端引流，右側頸總動脈作為動脈端回流連接CPB 管道，待ACT＞480s 后開始轉機；并行循環10min 后經左側第4 肋間開胸夾閉左側肺門，行右肺單肺通氣，調節適合的潮氣量及呼吸頻率；并行循環45min 后，開放左肺門，恢復雙肺通氣；并行循環30min 后停止CPB；停機90min 后實驗結束。CPB 期間采用體溫維持儀使肛溫維持在32～34℃，維持平均動脈壓（MAP）50～80mmHg，灌注流量40 ml/（kg·min）；非CPB 期間維持肛溫在36.0～37.5℃，MAP 60～110mmHg。停機前尾靜脈注射魚精蛋白中和多余肝素，機血回收后從尾靜脈輸入大鼠體內。術中通過動脈血氣分析結果調節大鼠內環境的穩定性，采用鎮靜藥、鎮痛藥和肌松藥來維持麻醉深度，必要時給予血管活性藥物維持大鼠生命體征。術中大鼠留置胃管行胃腸減壓，留置尿管用于術中尿液引流[5]。見圖1。

1.3.4 標本的采集 分別于CPB 前（T1）、開放左肺門即刻（T2）及實驗結束時（T3），經股動脈抽取動脈血0.5ml 行血氣分析，記錄紅細胞壓積（Hct）及血乳酸（Lac），并計算氧合指數（OI）和呼吸指數（RI）。實驗結束時經股動脈抽取動脈血2ml，離心后取上清液，于-80℃冰箱保存，采用ELISA 法檢測血清白細胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）的含量。取完血液標本后，剪取左肺組織，并分為上下兩部分。左肺上部經4% 多聚甲醛固定后，行光學顯微鏡檢查及病理損傷評分；左肺下部經液氮凍存后，于-80℃冰箱冷凍 保存，采用ELISA 法檢測肺組織IL-1β 和TNF-α 的含量。取完標本后，大鼠注入過量麻藥處死。

1.3.5 指標的檢測 ①肺功能檢測：根據動脈血氣分析結果計算氧合指數（OI=PaO2/FiO2）、呼吸指數（RI= P（A-a）O2/PaO2）。校正氧合指數＝PaO2/[FiO2×（P/760）]；肺泡-動脈血氧分壓差[P（A-a）O2]=（P- PH2O）×FiO2-PaO2-PaCO2/0.8；PH2O 為飽和水蒸氣壓，標準狀態下為47mmHg；P 為實際大氣壓強，遵義地區為680mmHg；FiO2（%）為吸入氧濃度，本動物實驗模型為99%。②肺組織光學顯微鏡檢查及病理損傷評分：左肺組織經4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋處理。用切片機將包埋好的石蠟切成3～5μm 薄片，先后經50%乙醇和正丁醇2 次脫水，經二甲苯脫蠟3 次（切片脫蠟要完全，否則妨礙正常染色），HE染色后封片，在光學顯微鏡下觀察肺組織形態，并拍攝圖片保存；每張病理切片隨機選擇3個高倍鏡視野（×100），采用CHENG 等[6]和DOS SANTOS 等[7]標準進行評分。按照肺泡及肺泡間質有無水腫液、紅細胞滲出及炎癥細胞浸潤進行評分，并取平均值作為此切片的評分。③ELISA 檢測：按照ELISA 試劑盒說明書檢測血漿及肺組織中TNF-α 和IL-1β 含量變化。由于CPB 后血液稀釋的影響，血漿TNF-α 和IL-1β的含量按如下公式進行校正：校正值=實測值×轉機前血細胞比積（Hct）值/實際Hct 值。

圖1 大鼠單肺體外循環肺損傷模型圖

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用重復測量設計的方差分析或單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血流動力學指標變化

T 組、C組與IR組大鼠T1、T2、T3的HR比較，符合正態分布和球形檢驗，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的HR 有差異（F=22.372，P= 0.000）；②3 組間的HR 有差異（F=8.701，P=0.000）；③3組HR變化趨勢有差異（F=7.556，P=0.000）。見表1。

T 組、C 組與IR 組大鼠T1、T2、T3的MAP 比較，符合正態分布和球形檢驗，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的MAP 有差異（F=66.997，P=0.000），②3 組間的MAP 有差異（F=7.104，P= 0.000），③3 組MAP 變化趨勢有差異（F=14.758，P= 0.000）。見表1。

2.2 各組大鼠Hct 及Lac 的變化

T 組、C 組和IR 組在T1、T2、T3不同時間的Hct比較，符合正態分布和球形檢驗，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的Hct 有差異（F= 54.630，P=0.000）；②3 組間的Hct 有差異（F= 188.425，P=0.000）；③3 組的Hct 變化趨勢有差異（F= 25.538，P=0.000）。見表2。

T 組、C組和IR 組大鼠T1、T2、T3的Lac比較，符合正態分布和球形檢驗，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的Lac有差異（F=66.464，P= 0.000）；②3 組間大鼠的Lac 有差異（F=55.746，P= 0.000）；③3 組的Lac 變化趨勢有差異（F=10.733，P= 0.000）。見表2。

表1 各組大鼠不同時間點血流動力學指標比較 （n =8，±s）

表1 各組大鼠不同時間點血流動力學指標比較 （n =8，±s）

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2.3 各組大鼠OI 及RI 的變化

T 組、C 組與IR 組大鼠T1、T2、T3的OI 比較，符合正態分布和球形檢驗，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的OI 有差異（F=63.795，P= 0.000）；②3 組間大鼠的OI 有差異（F=75.493，P= 0.000）；③3 組OI 變化趨勢有差異（F=29.727，P= 0.000）。見表3。

T 組、C 組與IR 組大鼠T1、T2、T3的RI 比較，符合正態分布和球形檢驗，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的RI 有差異（F=35.491，P= 0.000）；②3 組間大鼠的RI 有差異（F=46.995，P= 0.000）；③3 組RI 變化趨勢有差異（F=25.699，P= 0.000）。見表3。

2.4 各組大鼠肺組織病理學評分

T 組、C 組及IR 組大鼠在T3時肺組織病理損傷 評分為（0.75±0.24）、（2.13±0.25）和（4.42±0.83）分，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=101.974，P=0.000），進一步兩兩比較，經LSD-t檢驗，C 組高于T 組（P＜0.05），IR 組高于T、C 組（P＜0.05）。T組肺組織結構較清晰，肺泡壁完整（見圖2A）；C 組肺組織結構稍清晰，見少量肺泡壁塌陷及炎性滲出（見圖2B）；IR 組肺組織結構紊亂，充滿水腫液，肺泡壁斷裂，可見紅細胞和炎癥細胞浸潤（見圖2C）。

表2 各組大鼠不同時間點Hct 及Lac 比較 （n =8，±s）

表2 各組大鼠不同時間點Hct 及Lac 比較 （n =8，±s）

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表3 各組大鼠不同時點OI 及RI 比較 （n =8，±s）

表3 各組大鼠不同時點OI 及RI 比較 （n =8，±s）

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2.5 各組大鼠IL-1β、TNF-α 含量的變化

T 組、C 組、IR 組大鼠在T3時肺組織及血清中IL-1β、TNF-α 含量比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。各組大鼠肺組織及血清中IL-1β、TNF-α 含量 的變化趨勢一致；C 組IL-1β、TNF-α 的含量均高于T 組（P＜0.05），IR 組IL-1β、TNF-α 的含量高于T組和C 組（P＜0.05）。見表4。

圖2 各組T3 時間點肺組織病理切片 （HE×100）

表4 各組大鼠T3 時間點血清、肺組織中IL-1β、TNF-α 含量的比較 （n =8，ng/L，±s）

表4 各組大鼠T3 時間點血清、肺組織中IL-1β、TNF-α 含量的比較 （n =8，ng/L，±s）

注：①與T 組比較，P ＜0.05；②與C 組比較，P ＜0.05。

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3 討論

目前大多數學者認為，導致CPB 肺損傷的原因主要是血液與管道接觸、肝素-魚精蛋白等引起的全身性炎癥反應和主動脈開放后對肺組織造成的缺血再灌注損傷；據此特點本實驗模型采用雙側股靜脈作為靜脈端引流，右側頸總動脈作為動脈端回流進行CPB。預充液采用無血預充，總預充量為12 ml（晶體液:膠體液=1 ∶3），恰好為成年大鼠全身血容量的一半（成年大鼠血容量5.75～6.99 ml/100g）；大鼠正常平均心輸出量為150～180 ml/（kg·min）[8]，經過預實驗探索，本實驗大鼠采用心臟不停跳CPB，流量控制在心輸出量的1/4，約40 ml/（kg·min），可維持MAP 在50～80 mmHg；采用大鼠專用的小動物膜肺（交換面積0.05 m2，預充量3 ml）；實驗在CPB 前行全身肝素化，停機時又給予魚精蛋白拮抗；模擬血液與管道的接觸以及肝素-魚精蛋白等造成的全身炎癥反應。同時本實驗在CPB 過程中夾閉左側肺門45 min 后開放左肺門，模擬心臟復跳后肺組織的缺血再灌注損傷。與臨床實際操作不同，本實驗中大鼠心臟并不停跳，減少動物的創傷，使實驗動物能夠長時間的保持循環穩定（左肺再灌注后可維持生命體征平穩超過2 h），亦排除因心臟缺血再灌注對肺功能的干擾。

臨床常用OI 和RI 來作為判斷肺功能的指標。OI常用來評價肺氧合和換氣功能，與肺損傷呈正相關；RI 能客觀反映肺組織的實際氧合情況，與肺功能狀態呈負相關；兩者可綜合反映肺功能情況[9]。多種炎癥細胞因子與CPB 肺損傷關系密切[10]，其中最重要的細胞因子主要包括TNF-α 和白細胞介素（IL-1β、IL-6）[11]。本實驗中3 組大鼠T3時間點OI 低于T1，而RI 高于T1；說明隨著時間的延長，3 組實驗均可降低大鼠的肺功能。實驗結束時，C 組大鼠肺組織病理損傷評分、肺組織及血漿中的IL-1β、TNF-α 的含量高于T 組；而肺功能則比T 組降低；說明CPB后導致的全身炎癥反應可導致肺損傷。IR 組與C 組及T 組比較，大鼠Lac 濃度高于其他兩組，大鼠的組織氧供及代謝情況比其他兩組差；肺組織及血漿中的IL-1β、TNF-α 的含量，IR 組＞C 組＞T 組，而肺組織病理改變及肺功能下降程度，IR 組＞C 組＞T 組，表明IR 組左肺組織在左肺動脈開放后遭受CPB 全身炎癥反應和血再灌注損傷的雙重打擊，大鼠全身炎癥反應及肺組織損傷比其他兩組嚴重，能模擬臨床CPB 肺損傷的病理生理改變，大鼠單肺CPB 肺損傷自創模型成功建立。

大鼠的肺臟位于胸腔中部，分為左、右兩部分。與人類解剖結構不同，大鼠左肺為一個大葉，右肺分為4 葉（前葉、中葉、副葉、后葉），本實驗經左側第4 肋間開胸可直接暴露左肺門，易于夾閉。另外，實驗中夾閉肺門采用的是自制的小動物專用門脈閉合鑷，能夠輕松夾閉和開放肺門，減輕夾閉肺門時導致的損傷，利于動物的存活。在預實驗中，筆者發現本實驗的氣管導管（16 G 靜脈留置套管）沒用套囊，在機械通氣過程中易漏氣，致腹腔壓力增高、影響肺擴張，嚴重時可造成血流動力學的劇烈改變；經留置胃管后能很好地避免該類相關并發癥的發生。實驗中常規肌松劑的使用易導致尿儲留，留置尿管后能改善尿液引流，更易于液體的平衡管理。同時，術中通過動脈血氣分析結果調節大鼠內環境穩定，定時（間隔30～45 min）給予鎮靜、鎮痛和肌松藥來維持麻醉深度，以及實時監測和調控大鼠的血壓、心率和體溫，極大程度地模擬臨床CPB 術中的管理。

綜上所述，本自創實驗模型成功模擬臨床CPB 肺損傷的病理生理變化，適用于體外循環肺損傷及其機制的實驗研究，有助于推動體外循環肺保護的研究。