利妥昔與DC-CIK治療ALL患兒的療效及預后影響分析

苗巧，李艷秋

（四川省遂寧市中心醫院 血液科，四川 遂寧 629000）

急性淋巴細胞白血病（acute lymphocytic leukaemia, ALL）多發于2～5 歲兒童[1]，臨床常用化療及造血干細胞移植進行治療，但不良反應多[2]。隨著醫學技術發展，過繼免疫治療中樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞免疫療法（dendritic cells cytokine-induced-killer cell immunotherapy, DC-CIK）技術通過體外培養自身單個核細胞并回輸，消滅體內微小殘留病，阻止復發[3]。利妥昔通過結合淋巴細胞表面CD20 抗原消滅腫瘤，與化療聯合使用可顯著提高療效而不增加毒副作用[4]。本研究比較不同方案治療兒童ALL 的臨床療效，以及利妥昔對DC-CIK 治療預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2006年6月—2012年6月四川省遂寧市中心醫院經細胞形態學、免疫學、遺傳學及分子生物學確診分型并完成整個治療過程的ALL 患兒，并從中隨機選取50 例做回溯性調查研究。納入條件：①首次發病且為初次治療；②經免疫分型判定為前體B 型ALL（Pre B-ALL）；③CD20 表達量＞20%；④無乙型肝炎、慢性粒細胞白血病、腫瘤等其他疾病。對照組為化療聯合DC-CIK 治療，入組患兒25 例，年齡10個月至 13 歲，中位年齡6.7 歲；觀察組為利妥昔、化療及DCCIK 聯合治療，入組患兒25 例，年齡8個月至13 歲，中位年齡6.2 歲?；純褐饕R床表征為：發熱、疲倦、蒼白、出血等，并伴有骨關節痛；部分有肝、脾、淋巴結 腫大等浸潤表現。血象表征為：血紅蛋白、紅細胞及血小板減少，淋巴細胞比例增高，血液中出現數量不等的原始、幼稚淋巴細胞，多數患兒白細胞數目增高。骨髓涂片顯示原始淋巴細胞及幼稚淋巴細胞總數＞25%。

1.2 試劑與儀器

淋巴細胞分離液購自北京鼎國生物工程有限公司，Trizol 購自上海寶賽生物工程有限公司，Go ScriptTMReverse Transcription System 逆轉錄試劑盒和Go Tag qPCR Master Mix 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）試劑盒購自美國Omega 公司。超凈工作臺購自珠海造鑫儀器有限公司，日本三洋-80℃超低溫冰箱、芬蘭Biohit 移液槍、Eppendorf 臺式4℃離心機、美國ABI real-time PCR 儀、電熱恒溫水浴箱均購自上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照組治療方案 在兒童ALL 診療建議基礎上，根據本研究實際情況按危險程度不同將所有患兒分為低危組（low risk, LR）、中危組（middle risk, MR）及高危組（high risk, HR）[5]?；熯^程主要包括誘導緩解治療、早期強化治療、鞏固治療、延遲強化治療及維持治療。誘導治療采用長春新堿-柔紅霉素-左旋門冬酰胺酶-地塞米松（VDLD）進行治療，并根據患兒個體情況配合使用柔紅霉素（DNR）。早期強化治療采用環磷酰胺-阿糖胞苷-6-巰基嘌呤（CAM），中度及高度危險患兒需進行2 輪CAM 治療。鞏固治療根據患兒危險度不同使用不同劑量的甲氨蝶呤（HD-MTX）。延遲強化治療階段使用長春新堿-阿霉素-左旋門冬酰胺酶-VDLD 聯合CAM 方案。維持治療采用6-巰基嘌呤（6-MP）并HD-MTX 及長春新堿-VDLD 鞘注。中度危險患兒增加1 輪延遲強化治療及維持治療。

1.3.2 觀察組治療方案 觀察組患兒于誘導緩解治療及鞏固治療開始前1 天給予利妥昔靜脈注射，1 次/周，每次治療2 周，共4 次。0～10 歲患兒利妥昔使用濃度為125 mg/m2，10 歲以上兒童188 mg/m2。利妥昔使用時用生理鹽水稀釋至0.5 mg/ml。首次滴注初速度控制在0.5 mg/min 以下，若無不良反應發生可增加至1 mg/min。每次用藥前30 min 需靜脈注射VDLD 并肌內注射非那根以降低毒副作用發生。

1.3.3 DC-CIK 治療 達到細胞學完全緩解后進行DC-CIK 治療，治療前需經本院醫學倫理委員會批準并告知患兒及監護人。在確定患兒血象及凝血功能正常后，無菌抽取患兒骨髓液30～50 ml。將抽取的骨髓液用無血清RPMI 1640 于37℃，5%二氧化碳CO2條件下培養得到貼壁細胞，后加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）1 000 u/ml、白細胞 介素-4（IL-4）500 u/ml 培養10 d。培養過程中每3 天 換液1 次，收獲前3 天加入腫瘤壞死因子-α（TNF-α） 10 μg/L 誘導DC 成熟，檢測DC 免疫表型確定其成熟。在DC 即將成熟的同時，用血細胞分離機采集患兒外周血單核細胞50 ml，調整細胞密度至1×106個/ml 后與成熟DC 共培養。培養基中加抗CD3 單抗50 μg/ml、γ 干擾素（IFN-γ）1 000 u/ml、白細胞介素-1（IL-1） 100 u/ml、IL-2 300 u/ml，37℃、5% CO2，培養10 d，每3天換液1 次并于換液時補充IL-2。收獲擴增后的DCCIK 細胞并質檢，檢驗合格（無病原體，細胞活性達95%以上且細胞表型符合要求）后回輸?；剌敺? 次 進行，每次回輸間隔1 d，回輸時給予皮下注射IL-2，持續10 d。根據治療情況進行1～3個療程不等，每個 療程間隔3個月。統計兩組患兒治療前后外周血樣及骨髓樣本中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3-CD19+比例，比較其組內和組間差異。

1.3.4 Per2、Bmal1 及EVI1 mRNA 表達水平的檢測 先進行骨髓紅細胞裂解，而后提取總RNA，并合成cDNA，應用qRT-PCR 檢測EVI1 mRNA 表達，其中EVI1 正向引物為5'-GAGAGCAGCCTTACAGAT-3'，反向引物為5'-GACATGTTCCCATTCTCATGT-3'，產物長度為116 bp。β-actin 正向引物為5'-AGCTACGAGC TGCCTGAC-3'，反向引物為5'-AAGGTAGTTTCGTGGA TGC-3'，產物長度為150 bp。應用實時聚合酶鏈反應（real-time PCR）檢測Per2、Bmal1 mRNA 的表達，從NCBI 數據中查找Per2、Bmal1的基因序列，其中Per2正向引物為5'-AACTGCCCCTGGACTAAGAAAT-3'，反向引物為5'-GTTTGACCCGCTTGGACTT-3'，產物長度為114 bp。Bmal1 正向引物為5'-ACTGTGCTAAG GATGGCTGTTC-3'，反向引物為5'-TGGTTTGTAGTTT GCTTCTGTG-3'，產物長度為122 bp。β-actin 正向引物為5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向引物為5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，產物長度為150 bp。反應條件：首先95℃預變性2 min，循環1 次； 95℃變性3 s，循環40 次；60℃退火/延伸30 s，循環 40 次；然后依次再95℃預變性15 s、60℃變性1 min、95℃退火15 s 和60℃延伸15 s 進行熔解程序。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，治療前后比較采用配對t檢驗；計數資料以例表示，比較采用χ2檢驗；生存分析方法采用Kaplan-Meier 生存曲線；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患兒一般資料比較

兩組患兒性別、年齡、危險程度、體重增加例數、血紅蛋白及血小板達標例數、原幼稚淋巴細胞及完全緩解（complete response, CR）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患兒一般資料比較 （n =25）

2.2 淋巴細胞亞群比較

觀察組與對照組組內治療前后CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3-CD56+比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；其他指標組內治療前后比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。觀察組與對照組組間治療前后各項指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 MRD 陰性例數比較

在MRD 檢測中，判斷為陽性的標準條件為MRD ≥0.01%或檢出IgH/TCR 重排。比較兩組患兒化療及DC-CIK 治療結束后半年MRD 水平?；熃Y束后，對照組患兒MRD 陰性16 例（64%），觀察組患兒MRD 陰性23 例（80%），兩組患兒MRD 陰性差異有統計學意義（χ2=8.000，P=0.005）。DC-CIK 治療結束后半年對照組患兒MRD 陰性17 例（68%），觀察組患兒MRD 陰性24 例（96%），觀察組患兒MRD陰性率高于對照組（χ2=4.500，P=0.034）。

2.4 不良反應

對照組患兒化療過程中出現6 例（24%）輕、中度貧血，1 例（4%）血小板下降，2 例（8%）肝功能異常，5 例（20%）輕度感染，6 例（24%）發熱；DC-CIK治療過程中均出現不同程度發熱癥狀，4 例（16%）皮疹。觀察組患兒利妥昔聯合化療治療過程中出現輕、中度貧血患兒7 例（28%），2 例（8%）血小板下降，2 例（8%）心悸，1 例（4%）寒戰，6 例（24%）發熱，3 例（12%）感染，2 例（8%）惡心；DC-CIK 治療過程中也均有發熱癥狀，2 例（8%）皮疹。兩組患兒不良反應在藥物治療后改善，心、腎功能均無明顯變化，肝功能影響較小，未出現嚴重感染及代謝疾病。

2.5 遠期療效

對照組患兒3年無事件生存率（event free survival, EFS）為72%，觀察組患兒3年EFS 為84%，生存曲線見圖1。其中對照組患兒低危組EFS 為81%，中危組EFS 為67%，高危組EFS 為33%；觀察組 患兒低危組EFS 為94%，中危組EFS 為75%，高危組EFS 為50%。對照組患兒復發7 例（28%），平均復發時間（20.57±7.46）個月；觀察組患兒復發4 例（16%），平均復發時間（20.75±6.02）個月。兩組患者復發率和復發時間比較，差異無統計學意義（χ2=1.049，P= 0.306；t=0.094，P=0.926）。

表2 兩組患兒治療前后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3-CD19+比較 （n =25）

2.6 兩組Per2 和Bmal1 mRNA 表達水平的比較

治療前兩組Per2 和Bmal1 mRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后兩組Per2 和Bmal1 mRNA 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05），治療后表達下降，且觀察組低于對照組。見表3。

2.7 兩組EVI1 mRNA 表達水平的比較

圖1 兩組3年生存曲線

治療前兩組EVI1 mRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后兩組EVI1 mRNA 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組EVI1 mRNA的表達水平下降，且觀察組低于對照組。見表4。

表3 兩組Per2 和Bmal1 mRNA 表達水平的比較 （n =25）

表4 兩組EVI1 mRNA 表達水平的比較 （n =25）

3 討論

ALL 由失去成熟及定向分化功能的未成熟白細胞引起，根據免疫分型可分為T-ALL 和B-ALL，其中Pre B-ALL 是最常見的一種。利妥昔是全球首個治療惡性腫瘤的單抗藥物，其通過結合CD20 抗原、抑制淋巴細胞增殖及增強化療效果對Pre B-ALL 起治療作用。CD20 抗原在前體B 細胞至成熟B 細胞的各階段均于細胞膜上穩定表達，且不脫落不內化，利妥昔通過與CD20 結合激發機體自身免疫，消滅腫瘤細胞。約30%～40%的Pre B-ALL 表達CD20 抗原[6]，因此利妥昔對這類Pre B-ALL 具有治療作用。本研究結果表明，兩組先期治療使用利妥昔的患兒其治療后Th（CD3+CD4+）、NK（CD3-CD56+）高于未使用利妥昔的患兒，而兩者相比總T 細胞（CD3+）和B 細胞（CD3-CD19+）無差異。Th 細胞增加可使得機體細胞因子分泌增加，Th1 和Th2 分別參與細胞免疫及體液免疫；CTL 細胞可特異性殺傷腫瘤細胞；NK 細胞同樣具有抗腫瘤作用，是機體重要免疫細胞，參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒性試驗過程。說明利妥昔配合DCCIK 治療后機體特異性腫瘤殺傷能力增強。組間比較差異無統計學意義，說明利妥昔對后續細胞治療過程中免疫細胞的變化無明顯影響。

MRD 是誘發ALL 復發的主要因素[7]。DC-CIK治療前觀察組MRD 陰性率高于對照組；DC-CIK 治療結束后半年觀察組MRD 陰性率高于對照組。表明利妥昔對DC-CIK 清除MRD 的能力可能有一定程度促進作用。經過先期治療的ALL 患者其自身免疫力極低，微量殘留的腫瘤細胞易逃逸。而利妥昔可使淋巴細胞對化療藥物的細胞毒性更加敏感[8]，范麗霞等[9]研究發現，患者連續使用利妥昔治療4 周后其自身DC 細胞形態結構改變，對淋巴細胞刺激能力減弱，從而抑制淋巴細胞增殖。這些都使得DC-CIK 治療前的MRD 水平更低。體外培養的DC 細胞及殺傷細胞CIK回輸后免疫系統具有更大優勢，因此清除MRD 更加徹底。因此，利妥昔配合DC-CIK 治療的方法清除MRD 能力更強。

治療過程中觀察組感染率較對照組低，但惡心、心悸、寒戰等不良反應較對照組多。觀察組3年無事件生存率較對照組高，這與觀察組較高的MRD 陰性率相關。本研究結果表明，利妥昔配合DC-CIK 治療CD20 陽性的兒童Pre B-ALL 療效更佳，利妥昔對DC-CIK 治療預后有促進作用。此外，DWORZAK 等[10]研究顯示治療過程中一些患者會由CD20 陰性變為CD20陽性，這也使得利妥昔對CD20陰性的Pre B-ALL也具有潛在的治療作用。PIEVANI 等[11]在培養CIK時加入利妥昔藥物，發現CIK 抗腫瘤活性增強。該研究結果表明利妥昔配合DC-CIK 治療存在更廣泛的應用范圍，其療效也有進一步提高的可能。此外，本文發現，治療后兩組Per2 和Bmal1 及EVI1 mRNA 的表達水平下降，且觀察組低于對照組。提示觀察組治療方案能夠明顯降低Per2、Bmal1 及EVI1 mRNA 的表達。究其原因，Per2基因的表達產物—PER2 蛋白能夠抑制Cyclin B1 的轉錄，并上調p53 的蛋白量，從而影響腫瘤細胞周期的變化進程。而化療藥物又會對Per2基因的表達產生一定的抑制作用，因此在治療后的表達明顯下降。Bmal1基因則是通過在A3.01 細胞系內cpG 島的甲基化而影響腫瘤細胞的表達，此種甲基化過程能夠導致Bmal1基因正常轉錄表達出現沉默。因此，雖然Bmal1基因屬于抑癌基因，但隨著化療藥物的干預，其表達水平仍會發生一定程度的下降。EVI1過表達能夠致使粒細胞分化過程受阻，并使紅細胞的分化發生障礙，其對造血干細胞自身造血分化進程具有重要的調節作用。觀察組經過綜合治療后，EVI1 表達水平下降的程度更低，這也從側面證實觀察組治療方案相對更佳。但需指出，本研究由于樣本數量有限，后續還應加大樣本數量以期得到更加可靠的結論。此外，無論是利妥昔藥物還是DC-CIK 治療，其醫療成本較高，還不能被廣泛使用，這也限制了該方法的應用。