循環腫瘤細胞在晚期食管鱗癌患者療效評估中的臨床價值*

李彥，胡正宇，李祥華，楊林

（安徽醫科大學第一附屬醫院 1.腫瘤放療科，2.普外科，安徽 合肥 230032）

中國是食管癌高發的國家，每年因腫瘤死亡的患者中，約有一半為食管癌患者[1]。食管癌是中國第5 大常見的腫瘤，也是病死率排名第4 的腫瘤[2]。對不具備手術指征的患者，同步放化療為美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）指南中治療的金標準[3]。患者的外周血中存在可自發擴散入血的腫瘤細胞，其已被定義為循環腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTC）[4]，2007年美國臨床腫瘤學會（ASCO）將CTC 納入腫瘤標志物，可用于證實腫瘤的存在、發病過程、評估患者的預后、識別患者接受治療后的臨床治療效果；2010年美國癌癥聯合委員會（AJCC）將CTC 作為遠端轉移標準[M 分期，cM0（i+）]。本研究通過監測食管鱗癌患者外周血中CTC 的動態變化，評估CTC 與患者預后的相關性，進一步研究CTC 是否可作為食管鱗癌患者療效評估的指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月31 日—2016年12月31 日安徽 醫科大學第一附屬醫院腫瘤放療科的食管鱗癌患者38 例。其中，男性28 例，女性10 例；年齡46～90 歲，中位年齡72 歲。納入標準：年齡≥20 歲的患者；經病 理或者細胞學確診為食管鱗癌；患者自身情況不適宜手術，或術前評估病灶無法切除的Ⅲ期患者；出現遠處寡轉移的IV 期患者（任何T、N、M1、N3或T4b）；具有臨床易于觀察的可測量病灶；ECOG 評分≤2，無嚴重合并癥及放療禁忌證；患者可自行理解且自愿參加并簽署知情同意書。排除標準：合并其他惡性腫瘤的患者；放化療不耐受的患者；有嚴重的心肺肝腎功能障礙。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 治療方案

1.2.1 放療方案 儀器設備采用6 MV X 射線，使用西門子直線加速器行單純三維適行放療；所有入組患者的放療總劑量為DT：50 Gy/25 F（d1-33），1.8～ 2.0 Gy/次；GTV 包括食管癌原發病灶及腫大的淋巴結，CTV 包含GTV 及淋巴引流區；PTV：在CTV 的基礎上各外放0.5 cm，以及勾畫出需保護的周圍重要臟器。

1.2.2 化療方案 本研究中入組患者均采用TP 方案：紫杉醇135 mg/m2第1 天靜脈滴注；順鉑20 mg/m2第1～ 5 天；放療第1 天予以第1個周期化療，放療20 次左右行第2個周期化療，放療結束后繼續行2個周期鞏固化療，28 d 為1個化療周期。

1.3 CTC 的檢測

本研究采用陰性富集法外周靜脈血中篩檢CTC，對每位研究對象，在放療前7 d 內，同步放化療療程結束后的7 d 內均用真空采血管采集肘正中靜脈血，采集3.2 ml 靜脈血于ACD 抗凝管中，采血完畢后立即顛倒 混勻8 次。采集的血液在24 h 內去除血清，裂解液去除 紅細胞，磁珠孵育混勻去除白細胞，分離液分離富集的腫瘤細胞。使用CD45 抗體進行細胞免疫熒光檢測，8 F 著絲粒探針（CEP8）進行免疫熒光原位雜交（imFISH），CEP ≥3/DAPI+/CD45-，也即核內信號≥3 倍體，細胞核 DAPI 染色陽性，CD45 染色陰性定義為循環腫瘤細胞；CEP=2/DAPI+/CD45+為白細胞。見圖1。

圖1 CTC 鏡下視野

1.4 CTC 值及CTC、CEA、CA125、CA199 差值 的定義

CTC＞3個定義為CTC 陽性，CTC ≤3個定義為CTC 陰性[5-6]。放療前后CTC 的差值dCTC=放療前CTC-放療后CTC，放療前后CEA、CA125、CA199 的差值dCEA=放療前CEA-放療后CEA，dCA125=放療前CA125-放療后CA125，dCA199=放療前CA199-放療后CA199。

1.5 療效評估

根據實體腫瘤的療效評價標準RECIST 1.1 版，選取CT 所示食管病變最大層面的食管直徑為靶病灶，評估食管癌患者同步放化療前后靶病灶直徑的變化[7]。

1.6 隨訪

對38 例患者進行放療后維持2年的追蹤隨訪。隨訪內容包括：體格檢查，復查常規的血液學指標，頸、胸、腹部增強CT，依據檢查結果評估患者是否復發。隨訪于2019年5月1 日截止。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，符合正態分布的采用t檢驗，不符合正態分布的采用中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，比較采用秩和檢驗（Z檢驗），患者生存率比較用Kaplan-Meier 法及Log-rankχ2檢驗，運用Cox 回歸模型篩選影響預后的獨立影響因素，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 放療前后CTC 和隨訪指標的變化

本研究中38 例患者接受50 Gy 的放療劑量聯合同步化療后，靶病灶直徑均明顯縮小（P＜0.05），考慮50 Gy 的劑量即可達到臨床緩解。放療后的CTC、CEA、CA199、CA125 與放療前比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。放療前后白細胞，血紅蛋白，白蛋白和血小板差異有統計學意義（P＜0.05），腫瘤指標下降。見表1。

2.2 CTC 值與患者預后的生存分析

放療前CTC 陰性患者與放療前CTC 陽性的患者2年生存率比較，差異無統計學意義（χ2=2.743，P= 0.098）（見圖2A）；dCTC＞0 與dCTC ≤0 患者生存曲 線提示兩者2年生存率比較，差異有統計學意義（χ2= 10.844，P=0.001），即放療后外周血CTC 數值未增加的 患者，預后較好（見圖2B）。CEA、CA199、dCA125的取值對患者的預后無影響（見圖2C、E、H）。放療前CA125 值高于正常范圍的患者預后明顯優于CA125值低于正常范圍的患者（χ2=15.989，P=0.000）（見圖2G），dCTC、dCEA、dCA199、放療前CA125 值對患者的2年生存率有影響。dCEA＞0，dCA199＞0 的患者生存期較dCEA ≤0，dCA199 ≤0 的患者生存期長（見圖2D、F）。

表1 放化療前后食管癌患者一般資料變化

圖2 同步放化療前后患者生存曲線比較

2.3 放化療前后CTC 患者最大直徑的比較

放化療前后CTC 患者腫瘤最大直徑比較，差異有統計學意義（P＜0.05），放療前后CTC 陽性患者靶病灶最大直徑大于CTC 陰性患者。見表2。

2.4 多因素Cox 回歸分析

將dCTC＞0、CTC＞3、dCEA＞0、dCA199＞0、放療前 CA125＞35 u/ml 值進行Cox 回歸分析，結果顯示dCTC＞0 是食管癌患者同步放化療后預后的獨立影響因素[=3.970（95% CI：1.043，15.117），P=0.043]，放療前CA125＞35 u/ml 也是入組患者預后的獨立影響因素 [=31.642（95% CI：2.939，340.656），P=0.004]。見表3。

表2 放化療前后CTC 患者最大直徑的比較

表3 同步放化療后食管癌患者預后的多因素分析參數

3 討論

對不能手術的食管癌患者，同步放化療是治療的金標準，根據2018年NCCN 指南，50.0～50.4 Gy 劑量即可達到根治劑量。王玉芳等[8]指出，配合足夠劑量的紫杉醇聯合放療，50 Gy 組和60 Gy 組無生存差異，且高劑量組副反應較大，難以耐受后續化療，故本研究予以入組患者的放療劑量為50 Gy，放療后患者靶病灶最大直徑與放療前比較，差異有統計學意義，考慮50 Gy 即可達到有效局控，患者的CTC 值同樣有差異，即50 Gy 劑量，患者血液循環中的腫瘤細胞較治療前明顯減少，認為該治療方案有效。

本研究發現食管癌患者經過50 Gy 劑量放療，聯合TP 方案同步化療后，CTC 值較治療前總體降低，與許剛等[5]對食管癌患者同步放化療后CTC 值變化相致，LIU 等[9]對食管癌手術患者也有相同發現，手術患者術后和術后3 天外周血中CTC 的含量較術前都下降。再次驗證50 Gy 的劑量即可改善患者病情，局部控制腫瘤進展，為有效的治療。

國內外已有多項研究表明，CTC 與胸部腫瘤預后具有明顯相關性[10-12]，對食管癌的患者，國內外相關文獻提示CTC 可以作為判斷食管癌預后的獨立影響因素[13]。許剛等[5]認為，對食管癌患者放化療前后的CTC 均與患者的預后密切相關，本研究結果提示食管癌放療前CTC 與患者的預后相關性欠佳，經同步放化療后，放療前后CTC 的差值與患者預后明顯相關，即食管癌局部晚期患者經同步放化療后，CTC 值減少的患者預后較好，CTC 未見減少甚至增加的患者預后欠佳。經Cox 多因素分析顯示，dCTC 為判斷食管癌患者放化療后預后的獨立預后影響因素。CEA、CA199、dCA125 雖與患者的預后相關，但不能作為患者的預后獨立影響因素，需結合其他指標共同判斷。得到本結果的原因可能較放療前CTC 的值，dCTC 更能體現治療過程中CTC 值的動態變化，更能體現治療在改善患者預后中的重要作用，即患者得到可改善預后的治療后，CTC 值較前減少，預后得到改善。

本研究中的血清學指標CEA、CA125、CA199 均為消化道腫瘤的重要的腫瘤標志物，CA125 最早用于評估卵巢癌患者的復發及轉移，同時也被多項研究指出可作為評估食管癌發生、發展的重要指標[14-15]。ZHAO 等[16]在其研究中指出CA125 可以預測食管鱗癌患者淋巴結的轉移，血行轉移，并是獨立預后影響因素，且優于CA199 和CEA。在本研究中，通過對放療前后腫瘤指標值的對比發現，放療前CA125 值也可以作為食管癌患者同步放化療后的患者預后的獨立影響因素，與患者的預后密切相關。這可能與腫瘤細胞不僅可以合成CA125,且能主動將其分泌到細胞外相關[17]，仍需更大樣本量及專項的研究探討。

綜上所述，放療前后CTC 的差值，放療前CA125值可作為食管癌III、IV 期接受同步放化療治療患者預后的獨立影響因素，本實驗仍有許多不足，納入患者的樣本量尚有限，目前正在入組更多的患者，更大樣本的實驗正在設計中，同時將對患者進行更長時間的隨訪，日后將進行更深一步的探討。