一株大黃魚致病性溶藻弧菌的耐藥性及耐藥基因分析

陳洪清

(寧德市水產技術推廣站,福建寧德 352100)

大黃魚(Larimichthyscrocea)是中國主要的海水經濟魚類，福建省寧德市的大黃魚產量占全國的80%[1]。溶藻弧菌廣泛存在于海水中，溶藻弧菌病是大黃魚的主要病害之一[2]。目前溶藻弧菌病的防控以抗菌素為主，2017年,冼鈺茵等[3]對從廣州市出售水產品中分離得到的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌的耐藥性分析結果表明，水產動物的主要病原菌的副溶血弧菌和溶藻弧菌對萬古霉素等抗生素有明顯抗性，多重耐藥比例達100%，溶藻弧菌的多重耐受現象較為突出。病原菌耐藥性的產生與盲目地大量使用抗菌素有關。由于病原菌普遍存在耐藥性，因此有必要對病原菌進行耐藥性分析，以達到精準用藥、科學用藥的目的。

筆者于2018年用TCBS和TSA培養基從表現出體表和鰭條潰瘍、出血、鰓缺損癥狀的患病大黃魚上分離得到一株優勢菌，該菌株可在TCBS培養基上生長，菌落顏色為黃色；生理生化鑒定結果與溶藻弧菌一致，16SrDNA分析結果表明該菌與溶藻弧菌的同源率為99%，證實該菌為溶藻弧菌，命名為Val180620。攻毒結果顯示：Val180620菌株對大黃魚具有較強的致病力，在水溫25℃時腹腔注射感染，其對規格(20±2)g的大黃魚的LD50為2.38×106CFU(另文發表)。采用紙片擴散法(K-B法)和倍比稀釋法檢測了該菌的耐藥性，并對相關的耐藥性基因進行了分析，以期了解該菌的耐藥性情況，為溶藻弧菌病的科學防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

溶藻弧菌Val180620分離自表現出體表潰瘍等癥狀的大黃魚，保藏于-80℃。TSA培養平板和TSB培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司。磺胺甲噁唑、氟苯尼考、鹽酸多西環素、紅霉素、鹽酸環丙沙星、土霉素、恩諾沙星、硫酸新霉素、氨芐西林鈉購自Sigma公司，用于紙片擴散法的藥敏片來源于溫州市康泰生物科技有限公司[4-7]。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養

將溶藻弧菌Val180620接種于TSA培養基上，28℃培養24 h后，用接種環挑取單菌落，接種于10 mL TSB培養液，150 rpm震蕩培養24 h，平板計數法計數, 用TSB培養液將菌液稀釋到2×106CFU·mL-1備用。

1.2.2 紙片擴散法

在超凈工作臺中用移液器吸取700 μL濃度為2×106CFU·mL-1的菌液，均勻涂布于TSA平板上，5 min后，將藥敏片貼于平板上，于28℃靜置培養24 h后觀察。各含藥紙片的藥物含量如表1所示。

1.2.3 倍比稀釋法

按表2配置藥品溶液，配制9種藥物的母液初始濃度為2 048 μg·mL-1。在超凈工作臺中，將藥物于96孔細胞培養板中使用滅菌TSB肉湯以2n進行倍比梯度稀釋，共計12個稀釋度。各藥物的起始濃度均為1 024 μg·mL-1，配好的藥物最終濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1，每孔藥液體積為120 μL。再往96孔細胞板內加入與藥液等體積，濃度為2×106CFU·mL-1的菌液，于28℃靜置培養24 h，觀察試驗結果，無菌生長的最低藥物濃度即為抑制細菌生長的最低濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。取MIC孔前3個稀釋度的培養液各100 μL，涂布于TSA培養基上，于28℃靜置培養24 h，無菌生長的最低藥物濃度判定為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。

1.2.4 耐藥基因的PCR檢測

根據文獻報道耐藥基因引物序列(表3)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。從TSA平板挑取單菌落，接種于TSB培養基，于28 ℃繼續培養24 h后，收集菌體，按照OMEGA細菌DNA提取試劑盒方法提取菌體DNA作為PCR模板，PCR體系為：Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)25 μL，菌DNA模板 1 μL，上游引物(10 μM)2 μL，下游引物(10 μM)2 μL，滅菌水 20 μL。PCR反應條件95℃ 3 min；94℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72℃ 40 s 34個循環；72℃ 7 min。反應完成后對PCR產物進行2%瓊脂糖電泳檢測，觀察結果。

2 結果與分析

2.1 紙片擴散法

以紙片擴散法(K-B法)測定菌株Val180620對9種藥物的敏感性結果見表4。參照 CLSI標準[8]可以得知，菌株對氨芐西林鈉耐藥，對氟苯尼考、磺胺甲噁唑高度敏感。

表1 藥敏紙片含藥量Tab.1 Drug content in drug sensitive slips

表2 各藥物稀釋所用的稀釋液Tab.2 Diluents used for drug dilution

注：A:無菌水；B:蒸餾水；C:90%丙二醇；D:90%甲醇；E:pH為8的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液；F：pH為6的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液；G：2.5 mol·L-1NaOH；H:95%乙醇

Note: A：aquae sterilisata; B: DD H2O; C:90% propylene glycol; D: 90% CH3OH; E: pH 8，0.1 mol·L-1phosphate buffer; F: pH 6.0，0.1 mol·L-1phosphate buffer; G: 2.5 mol·L-1NaOH; H: 95% CH3CH2OH

2.2 倍比稀釋法

按CLSI(2010)，由表5可知，恩諾沙星、土霉素、硫酸新霉素、磺胺甲噁唑、氟苯尼考對菌株Val180620有較好的抑菌和殺菌效果，鹽酸多西環素、紅霉素抑菌和殺菌效果較差。

2.3 耐藥性基因檢測

耐藥性基因PCR產物電泳檢測結果顯示，β-內酰胺類耐藥性基因blaCTX-M和喹諾酮類耐藥基因qnrVC擴增片段大小與目標基因一致。qnrVC5以及四環素類耐藥基因tetS、tetM擴增片段大小與目標基因相比有差異(見圖1)，將片段回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果表明分離菌株含有耐藥基因blaCTX-M和qnrVC。

表4 菌株Val180620對9種藥物敏感試驗結果Tab.4 Sensitivity of strain Val180620 to 9 kinds of antibiotics

注：S表示敏感，R表示耐藥

Note: S is sensitive, R is resistant

表5 菌株Val180620對9種藥物的MIC和MBCTab.5 MIC and MBC of strain Val180620 to 9 kinds of antibiotics

注：按照 CLSI標準，MIC值和MBC值大于16為耐藥

Note: According to CLSI standards, MIC and MBC values more than 16 are resistant

3 結果與討論

溶藻弧菌廣泛存在于海水中，可危害魚、蝦、貝等多種水產經濟動物[9]。目前水產養殖魚類的細菌病防控仍以抗菌素等藥物為主，養殖戶用藥多憑經驗，存在一定的盲目性，所使用的藥物常不能得到理想的治療效果，不僅延誤了病情，同時加重了藥物殘留，因此有必要檢測病原菌的耐藥性，為精準用藥提供依據。

紙片擴散法結果表明，來自大黃魚的致病溶藻弧菌對氟苯尼考、磺胺甲噁唑等藥物高度敏感，對喹諾酮類藥物恩諾沙星、鹽酸環丙沙星，四環素類藥物鹽酸多西環素、土霉素，大環內酯類藥物紅霉素等敏感，而對β-內酰胺類藥物氨芐西林鈉等耐藥。氟苯尼考、鹽磺胺甲噁唑、氨芐西林鈉等藥物MIC和MBC實驗結果與紙片法基本一致，但四環素類藥物鹽酸多西環素、大環內酯類藥物紅霉素MIC和MBC結果與紙片擴散法不一致。據報道，在未加入穩定劑的情況下，鹽酸多西環素、紅霉素水溶液的穩定性較差[10-11]，推測本研究中鹽酸多西環素、紅霉素的MIC和MBC的試驗結果與紙片法的試驗結果存在差異，與鹽酸多西環素和紅霉素水溶液的穩定性差有關。

水產常用藥氨芐西林鈉屬于β-內酰胺類藥物，恩諾沙星、鹽酸環丙沙星屬于喹諾酮類藥物，鹽酸多西環素、土霉素屬于四環素類藥物，為了進一步分析菌株耐藥的內在原因，本研究進一步檢測了菌株β-內酰胺類耐藥性基因blaCTX-M，喹諾酮類耐藥基因qnrVC、qnrVC5以及四環素類耐藥基因tetS、tetM的攜帶情況，結果顯示菌株Val180620同時攜帶有blaCTX-M和qnrVC這兩種耐藥基因。雖然攜帶喹諾酮類耐藥基因qnrVC，但菌株Val180620卻對喹諾酮類藥物恩諾沙星和鹽酸環丙沙星敏感。推測該基因可能不是喹諾酮類藥物恩諾沙星和鹽酸環丙沙星的唯一決定性耐藥基因，有必要對更多的耐藥相關基因進行檢測和測序分析。

韓風杰等[12]發現山東地區魁蚶中的溶藻弧菌對氨芐西林鈉表現出較強的敏感性，胡夢華等[13]從發病蝦中分離的一株溶藻弧菌對磺胺甲噁唑具有一定的耐藥性，與本研究的結果不一致，說明不同環境條件、不同養殖方式、不同宿主上得到的溶藻弧菌對藥物的敏感性存在差異。因此在防治溶藻弧菌病時使用抗菌藥，不應僅憑經驗或照搬書本，而應進行藥敏檢測，根據藥敏檢測結果選擇合適的藥物，以達到精準用藥、科學用藥的目的。