CCR5Δ32基因多態性在遼寧省老年系統性紅斑狼瘡診斷中的意義

張程 吳姍姍 呂丹 張婷婷 張藝凡

(遼寧中醫藥大學附屬醫院檢驗科，遼寧 沈陽 110032)

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種常見的累及多臟器的慢性炎癥性自身免疫病，臨床表現復雜〔1〕，發病率逐年增高，且女性比男性多發〔2〕。SLE發病機制復雜，受多重因素影響，包括基因、環境和趨化因子等，趨化因子受體在SLE炎癥反應中的作用成為近年來熱門的課題〔3〕。

趨化因子是由多種細胞分泌的具有可引起白細胞趨化特性的細胞因子，參與多種免疫性疾病及炎癥性疾病的致病過程。趨化因子根據其蛋白中半胱氨酸殘基的排列，可分為CXC型、CC型、C型和CX3C型四種〔4〕，CC型是炎性細胞典型的趨化因子〔5〕。趨化因子受體為7次跨膜G蛋白耦聯受體蛋白，表達于免疫細胞表面〔6〕，根據結合趨化因子不同分為CXC型和CC型〔7〕。CCR5是CC類趨化因子的受體，通過調控T細胞和單核細胞來參與免疫反應〔8〕。CCR5編碼基因位于人類3P21染色體短臂上，已發現該編碼區出現缺失32 bp的基因型(CCR5Δ32/rs333)，該缺失導致純合子個體表面無CCR5的表達，雜合子個體CCR5表達量下降〔9〕。

目前已有研究支持CCR5Δ32基因型個體對人類免疫缺陷病毒(HIV)-1耐受，其缺失的CCR5可以抵抗HIV對宿主細胞的攻擊〔10〕，然而該基因型在自身免疫疾病中的作用仍存在爭議。Pokorny等〔11，12〕研究認為CCR5Δ32可以降低類風濕關節炎的易感性，而Samson等〔9〕持反對意見。CCR5Δ32基因型對多發性硬化癥的影響也同樣存在爭議〔13，14〕。目前認為CCR5Δ32基因型對SLE的影響根據人種、地域而發生變化〔5，15，16〕，但并沒有針對老年人群中該指標與SLE關系的研究。本研究通過研究遼寧地區老年人群中CCR5基因多態性、SLE活動度相關檢測指標，與對照組比較，來明確老年人群中SLE易感性及SLE活動度與CCR5基因多態性的關系。

1 材料和方法

1.1研究對象 遼寧中醫藥大學附屬醫院2017年1月至2018年9月門診及住院SLE患者500例，其中女258例，男242例，年齡60～66歲，平均(63.2±2.5)歲。SLE診斷標準采用美國風濕協會SLE診斷標準(1982年制定)，符合該標準中4條者可確診。對照組從遼寧中醫藥大學附屬醫院遼寧省體檢正常老年人中抽取500例，其中女252例，男248例，平均年齡(64.5±3.8)歲。兩組性別和年齡均無顯著差異(P>0.05)。

1.2材料 PCR擴增試劑盒(天根生化科技有限公司)，抗核抗體(ANA)譜及dsDNA抗體檢測試劑盒(歐盟)，瓊脂糖凝膠電泳采用伯樂電泳槽。

1.3方法 ①臨床指標檢測：兩組人群分別進行以下項目檢查：基礎檢查包括發病年齡、身高、體重、體重指數(BMI)。SLE活動度評價指標(參照SLEDAI標準)包括血清C3、C4濃度(邁克生物，四川)，ANA滴度(>1∶100為陽性)(歐蒙，北京)，雙鏈DNA抗體(歐蒙，北京)，外周血白細胞總數。②CCR5Δ32基因多態性檢測：從新鮮外周血提取基因組DNA(天根DNA提取試劑盒)，PCR法擴增CCR5基因(天根PCR擴增試劑盒，引物正義鏈：ACCAGATCTCAAAAAGAA，反義鏈：CATGATGGTGAAGATAAGCTTCA)，25 μl反應體系中含有2.5 μmol/L dNTP 2 μl，2.5 μmol/L Mg2+1.5 μl，2.5 μmol/L正、反向引物各2.5 μl，5 U/μl Taq 0.25 μl，10 ng/μl模板10 μl，10×緩沖液2.5 μl，去離子水3.75 μl。反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30個循環；72℃延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段為225 bp(野生株)和193 bp(突變株)。

1.4統計學分析 采用SPSS11.5軟件進行χ2檢驗、Hardy-Weinberg檢驗。

2 結 果

2.1SLE組臨床檢測指標結果 SLE組≤SLEDAI 3條人數占57.4%，C3、C4濃度均值均在正常范圍內，ANA滴度陽性61.6%，抗dsDNA抗體陽性66.0%。

2.2CCR5基因多態性結果判讀 通過電泳鑒定可以直觀分析出，CCR5為野生型時，產物片段為225 bp；若CCR5基因發生32堿基缺失時，產物片段為193 bp，當兩個片段同時出現時即為雜合子(CCR5/CCR5Δ32)，見圖1。樣本中均無CCR5Δ32/CCR5Δ32純合子出現。CCR5基因型及等位基因在兩組研究對象中符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.76，P>0.05)，CCR5的基因頻率在兩組研究對象中顯著高于CCR5Δ32。見表1。

2.3SLE患者CCR5/CCR5基因型組與CCR5/CCR5Δ32基因型組臨床檢測指標比較 將SLE組按基因型的不同分成CCR5/CCR5組與CCR5/CCR5Δ32組。兩基因小組C3、C4、ANA滴度均無差異，CCR5/CCR5Δ32組發病年齡低于CCR5/CCR5組，但無顯著差異。突變組抗dsDNA抗體陽性率高于野生組(P<0.05)。見表2。

M為marker，除2號為雜合子(CCR5/CCR5Δ32)外，其余均為野生型純合子(CCR5/CCR5)

表1 兩組CCR5基因多態性的差異〔n(%),n=500〕

表2 SLE患者CCR5/CCR5基因型組與CCR5/CCR5Δ32基因型組臨床檢測指標比較

3 討 論

CCR5是CC類趨化因子受體，可結合RANTES、MIP-1α等結合參與炎癥反應，介導SLE等自身免疫性疾病對各器官組織的攻擊。CCR5Δ32是CCR5的突變株，缺失32個堿基使編碼CCR5的基因功能喪失，而成為無效受體，從而無法完成炎癥反應，是機體的一種自我保護機制〔17〕。全球統計數據表明，CCR5Δ32等位基因頻率為4.18%，各個國家的數據有較大區別，歐洲其基因頻率為5%～16%，而美洲、日本、中國的頻率較低〔18〕。楊仕貴等〔15，19〕統計安徽省漢族人群CCR5Δ32等位基因頻率為0.63%。

Schauren等〔15〕發現CCR5Δ32基因頻率存在的差異不僅受人種影響外，還與SLE患者疾病進展程度、發病年齡相關，對巴西南部SLE女性患者檢查發現，有CCR5Δ32基因存在的患者其發病年齡較未突變患者更早〔20〕，從而證實了這個觀點。本實驗CCR5Δ32突變組比未突變組的發病年齡較低，但沒有統計學意義，不除外人種基因突變頻率低的影響，也與患者納入隊列時的病情、樣本量不夠大等因素有關。

有研究發現，SLE發病年齡越早，損傷程度越大，受累器官越多，以腎臟損傷最為明顯，且ANA及抗dsDNA抗體陽性率越高〔21〕。本研究結果可能由于CCR5Δ32的突變提高了ds-DNA抗體陽性率，而ds-DNA抗體陽性率的提高是否影響SLE的進展及受累器官，特別是腎臟損傷的嚴重程度，還需要進一步通過對腎臟相關檢查與dsDNA抗體的聯合分析來深入研究。

綜上，遼寧老年人群中主要以CCR5野生基因型為主，CCR5Δ32突變頻率較低。CCR5Δ32突變可以通過提高抗dsDNA抗體的陽性率來影響SLE。