NaOH處理對霞多麗葡萄籽原花青素的影響

張 杰，王文雅,*，袁其朋*

（1.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029；2.北京化工大學廈門北化生物產業研究院有限公司，福建 廈門 361022）

葡萄籽是紅酒產業的主要副產物之一，含有較多活性物質，如維生素、礦物質、脂類、蛋白質、碳水化合物、多酚等，其中最著名是原花青素（procyanidin，PC）。來源于葡萄籽的PC有很好的藥理學功能，如抗氧化性、抗炎性和廣譜抗菌性等[1]。PC的上述生理學活性使其在制藥、食品、醫療保健等領域應用廣泛。黃烷-3-醇（兒茶素（catechin，C）/表兒茶素（epicatechin，EC））和其衍生物（表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin 3-O-gallate， ECG））為葡萄籽中PC的主要聚合單元，它們通過CüC鍵聚合成B型的PC[2-3]。研究發現葡萄籽中65% PC的聚合度（degree of polymerization，DP）大于5[3]，生物利用率研究顯示，僅DP小于5的PC能被人體吸收[4-7]。雖然PC有很好的生物活性，但多數大分子PC不能被人吸收，因此將高聚原花青素（polymeric procyanidins，PPC）（DP＞5）轉化為能被人吸收的低聚原花青素（oligomeric procyanidins，OPC）（DP＜5）或單體是葡萄籽高附加值利用的重要途經之一。

目前，國內外PC解聚的方法主要有單體鏈斷裂劑法[8]、弱酸法[3]、酸式鹽法[9]、催化劑加氫裂解法[10]、堿裂解法[11]等。這些解聚方法中，部分方法或由于生產成本高，或對設備要求苛刻，或者易產生有毒刺激性氣體，不適用于食品工業生產。堿裂解法最早被應用于蔓越莓中制備A型PC，結果顯示二聚體增加了8.4 倍，單體增加14.9 倍，綜合評價堿法表現出了較高的工業應用潛力，但堿法對葡萄籽中B型PC制備的影響及活性研究鮮見報道。因此，本實驗研究不同條件NaOH處理對葡萄籽中提取B型PC制備的影響，包括PC的平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）、PC含量、體外抗氧化活性、OPC組分的變化等，并且探究PC含量和體外抗氧化活性的關系。研究確定堿法對于葡萄籽中B型PPC有解聚和促進OPC釋放的作用，并且確定最佳水解條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

法國霞多麗葡萄籽（酒廠） 西安昊軒生物科技有限公司；葡萄籽PC（純度95%） 西安瑞林生物科技有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒 碧云天生物技術公司；福林-酚試劑、標準品C 美國Sigma公司；NaOH（分析級） 北京化工廠；乙酸（色譜級） 天津賽孚瑞科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜級） 賽默飛世爾科技有限公司。

標準品EC、ECG、原花青素二聚體B1、原花青素二聚體B2成都曼思特生物科技有限公司；原花青素二聚體B3、原花青素三聚體C1上海源葉科技有限公司；原花青素四聚體A2北京大道正行科技發展有限公司；2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；香草醛、芐硫醇、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate，DPPH） 上海麥克林生化科技有限公司。以上標準品純度均大于96%。

1.2 儀器與設備

MS-H-ProT加熱磁力攪拌器 美國賽洛捷克有限公司；V-5100B紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；LC-20AT液相色譜儀 日本島津公司；Seven2Go高級單通道便攜式pH計 梅特勒-托利多國際貿易有限公司；50 mL NEST刻度尖底離心管 北京科華經緯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 霞多麗葡萄籽預處理

參考Gu Liwei等[12]的方法，略有修改。葡萄籽洗凈，冷凍干燥48 h，粉碎過20 目篩。稱粉碎后葡萄籽50.00 g，置于500 mL燒杯中，加入250 mL正己烷，300 r/min磁力攪拌脫脂12 h，靜置30 min，抽濾得濾渣，置于通風櫥中，靜置24 h。上述實驗操作盡量在避光條件下進行。

1.3.2 堿預處理及PC粗提液制備

參考文獻[11-12]的方法，略有修改。脫脂葡萄籽0.500 0 g，置于50 mL離心管中。加入5 mL NaOH溶液，NaOH溶液濃度分別為0、1、2、4、6 mol/L，處理溫度分別為40、60、80 ℃，處理時間分別為15、30、60 min。處理結束后，將離心管置于冰浴中至調pH值，用4 mol/L HCl溶液調節pH值至6～7，加入丙酮-水-乙酸（70∶29.5∶0.5，V/V）溶液，將離心管溶液稀釋至35 mL。稀釋后的處理液37 ℃水浴超聲10 min。隨后，室溫遮光，600 r/min攪拌提取50 min，9 000 r/min離心15 min，收集上清液即獲得PC粗提液，粗提液備測。在此基礎上，設定溫度和時間為60 ℃、15 min，NaOH溶液濃度分別為8、10、15、20、25 mol/L，按照前述流程進一步優化堿裂解條件，提取PC備測。

1.3.3 PC粗提液的除鹽液制備

參考Li Zheng等[10]的方法，用乙酸乙酯萃取去除粗提液中的鹽分。取5.00 mL PC粗提液于25 mL雞心瓶中，45 ℃旋干，用15 mL超純水溶解固體洗滌雞心瓶，轉移至125 mL分液漏斗。加30 mL乙酸乙酯，萃取3 次，收集乙酸乙酯相。取72 mL乙酸乙酯相于100 mL雞心瓶中，45 ℃旋干。用4 mL甲醇溶解洗滌雞心瓶，過0.45 μm濾膜，濾液備測。

1.3.4 PC的mDP測定

各稱10.00 mg C、EC、ECG、原花青素二聚體B1、原花青素二聚體B3置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解，定容得1 mg/mL標準品溶液。C、EC、ECG為末端單元對照直接進行液相色譜測定，原花青素二聚體作為延伸單元的對照進行硫解實驗。通過硫解原花青素二聚體B1和原花青素二聚體B3，鑒定C末端及3,4-反-表兒茶素芐硫醚、3,4-反-兒茶素芐硫醚和3,4-順-兒茶素芐硫醚[13]。

硫解的方法參考文獻[2,12,14-15]，采用反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）略有改動。各取50 μL甲醇和原花青素二聚體B1及原花青素二聚體B3溶液分別置于250 μL內插管中，加入50 μL體積分數3.3% HCl-甲醇溶液和100 μL體積分數5%芐硫醇-甲醇溶液，然后將置于1.5 mL的液相小瓶中的內插管蓋緊，40 ℃水浴30 min，-20 ℃保存10 h。甲醇組為溶劑對照組，PC粗提液及除鹽液按照上述操作硫解，硫解產物采用液相色譜檢測。

HPLC測定條件參考Gu Liwei等[15]的方法。Diamonsil-C18色譜柱（250 mmh4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長280 nm；流動相A為2%乙酸溶液，流動相B為甲醇；梯度洗脫：0～45 min，15%～80% B；45～50 min，80% B；50～55 min，80%～15% B；55～70 min，15% B。mDP按式（1）計算：

式中：末端單元分別為C、EC、ECG；延伸單元芐硫醚分別為3,4-反-兒茶素芐硫醚、表沒食子兒茶素芐硫醚、3,4-順-兒茶素芐硫醚、3,4-反-表兒茶素芐硫醚、表兒茶素-3-O-沒食子酸酯芐基硫醚。

1.3.5 正相高效液相色譜（normal-phase high performance liquid chromatography，NP-HPLC）分析OPC組分

各稱10.00 mg C、EC、ECG、原花青素二聚體B1、原花青素二聚體B2、原花青素二聚體B3、原花青素三聚體C1、原花青素四聚體A2置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解固體，定容得1 mg/mL標準品溶液，過0.45 μm濾膜，備測。各取1 mL 1 mg/mL的C、EC、ECG、原花青素二聚體B1、原花青素二聚體B2、原花青素二聚體B3溶液于10 mL帶塞螺紋玻璃管，混合均勻得混合標準品1。同樣配制混合標準品2（C、EC、ECG）、混合標準品3（原花青素二聚體B1、原花青素二聚體B2、原花青素二聚體B3）、混合標準品4（C、EC、ECG、原花青素二聚體B1、原花青素二聚體B2、原花青素二聚體B3、原花青素三聚體C1、原花青素四聚體A2），-20 ℃貯存備測。

HPLC條件參考Choy等[16]的方法，略有改動。Develosil diol 100色譜柱（250 mmh4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長280 nm；流動相A為乙腈-乙酸溶液（98∶2，V/V），流動相B為甲醇-超純水-乙酸溶液（95∶3∶2，V/V）；梯度洗脫：0～3 min，7% B；3～53 min，7%～37.6% B；53～56 min，37.6%～100% B；56～69 min，100% B；69～75 min，100%～7% B；75～85 min，7% B。參考文獻[16]的液相色譜測定條件對DP大于10的PC檢測有干擾，因此將流動相A改為乙腈-水（98∶2，V/V），其他測定條件同上。

1.3.6 PC含量的測定

參考?am等[17]的方法，略有修改。稱25.00 mg C置于25 mL容量瓶，加入適量甲醇溶解C，定容得100 μg/mL母液。分別取1、2、4、6、8 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得10、20、40、60、80 μg/mL梯度溶液。取1.00 mL待測液于10 mL試管中，加2.50 mL質量分數1%香草醛-甲醇溶液，加2.50 mL體積分數25% H2SO4-甲醇溶液，30 ℃水浴15 min，于波長500 nm處測吸光度，甲醇作空白對照。以吸光度為縱坐標，以C質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=0.008 1x+0.068（R2=0.999 8）。除鹽液稀釋8 倍，進行測定，根據方程計算，結果以C當量表示（μg/mL），以干基計。

1.3.7 體外抗氧化測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Xu Changmou等[18]的方法，略有修改。稱6.26 mg Trolox置于25 mL容量瓶，加入適量甲醇溶解Trolox，定容得1 000 μmol/L母液。分別各取1、2、4、6、8 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得100、200、400、600、800 μmol/L Trolox溶液。取100 μL待測液于10 mL試管，加入3.90 mL 2.5 mg/100 mL DPPH-甲醇溶液。空白組為甲醇，于波長515 nm處測得吸光度A0。對照組在30 ℃黑暗條件下反應60 min，于波長515 nm處測定吸光度A。DPPH自由基清除率按式（2）計算。以清除率為縱坐標，以Trolox為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=0.055x+0.976 2（R2=0.999 6）。除鹽液稀釋8 倍后，進行測定，根據方程計算，結果以Trolox當量（μmol/g）表示，以干基計。

1.3.7.2 Fe3+還原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）測定

參考相關文獻[19-20]的方法，略有改動。稱量12.52 mg Trolox置于50 mL容量瓶，加入適量超純水溶解，定容得2 000 μmol/L母液。分別取0.5、2.5、5、7.5 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得150、300、600、900、1 200、1 500 μmol/L Trolox溶液。取試劑盒中TPTZ稀釋液、TPTZ溶液和檢測緩沖液以10∶1∶1比例混勻，37 ℃孵育60 min得FRAP工作液。取180 μL FRAP工作液加入到96 孔板中，加入5 μL待測樣品混勻，37 ℃孵育5 min，于波長593 nm處測定吸光度，超純水作空白對照。以還原產物吸光度為縱坐標，Trolox為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=0.000 6x-0.027 7（R2=0.998 3）。除鹽液稀釋8 倍后，進行測定，根據方程計算，結果以Trolox當量（μmol/g）表示，以干基計。

1.3.7.3 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考相關文獻[19,21]的方法，略有改動。取100 mL 7 mmol/L ABTS溶液和50 mL 2.45 mmol/L K2S2O8溶液置于250 mL藍色螺紋瓶，25 ℃黑暗條件下反應12 h，得ABTS反應初始液。用乙醇稀釋ABTS反應初始液于波長734 nm處測定吸光度為0.700f0.200。稱12.52 mg Trolox置于50 mL容量瓶，加入適量甲醇溶解，定容得2 000 μmol/L母液。分別取0.5、2.5、5、7.5 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得100、500、1 000、1 500 μmol/L溶液。取30 μL待測液于10 mL試管中，加入3.00 mL ABTS-甲醇溶液，30 ℃反應6 min，在734 nm波長處測定吸光度A，空白組為乙醇溶液A0。清除率計算同式（2）。以ABTS陽離子自由基清除率為縱坐標，以Trolox為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=0.000 4x-0.024 8（R2=0.995 9）。除鹽液稀釋8 倍后，進行測定，根據方程計算，結果以Trolox當量表示（μmol/g），以干基計。

1.3.8 PPC的制備

參考Saucier等[22]的方法，略有改動。制備文獻[22]中報道的mDP較高的組分F1。稱2.00 g 95%葡萄籽PC于200 mL容量瓶，加入適量超純水溶解，定容得10 g/L母液。取50 mL的母液置于250 mL的分液漏斗中，加入100 mL乙酸乙酯萃取，萃取3 次，收集水相。將水相置于100 mL雞心瓶中，45 ℃旋干。加入25 mL的甲醇重新溶解和洗滌雞心瓶，并將液體轉移至100 mL離心管中，加入25 mL氯仿，混合均勻后靜置30 min。將液體分別置于2 個50 mL離心管中，10 000 r/min離心15 min。棄上清液，收集固體，加少許甲醇溶解，將溶液置于100 mL雞心瓶，45 ℃旋干，得50.00 mg PPC固體。

稱10.00 mg PPC，置于10 mL容量瓶，加入適量甲醇溶解，定容得1 mg/mL PPC，過0.45 μm濾膜，備測。進行硫解實驗，測定PPC的mDP。

中和反應會生成較多NaCl引起柱子堵塞，因此選取低濃度2 mol/L NaOH溶液進行研究。稱20.00 mg PPC于50 mL離心管中，加入1 cm轉子，加20 mL 2 mol/L的NaOH溶液，60 ℃、200 r/min水浴15 min。然后將離心管冰浴，200 r/min持續攪拌，用4 mol/L HCl溶液調節pH值至6～7。取15 mL粗反應液按照1.3.3節步驟除鹽得除鹽液，過0.45 μm濾膜，備測。

1.4 數據處理

所有實驗重復3 次，采用Origin 2017處理數據并作圖，結果以fs表示。用One-way ANOVA分析顯著性差異，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 NaOH處理條件對PC的mDP的影響

圖1 RP-HPLC檢測除鹽液樣品、聚合終端標準品、聚合延伸單元（二聚體硫解）色譜圖Fig. 1 RP-HPLC analysis of desalted sample, polymerization terminal standard, polymerization extension unit (dimer thiolysis)

圖2 NaOH處理對PC mDP的影響Fig. 2 Effect of different NaOH pretreatments on the mDP of procyanidins

如圖1A所示，分離出9 個峰，其他樣品出峰相似。圖1B～G為PC末端單元及延伸單元的出峰時間，與Gu Liwei等[12]結果一致。其中峰5和峰8對應的表沒食子兒茶素芐硫醚和表兒茶素-3-O-沒食子酸酯芐基硫醚無標準品，只能根據相關文獻出峰時間及順序鑒定[12,14-15,23-24]。由圖2A可知，粗提液組中經NaOH處理的實驗組與NaOH濃度為0 mol/L的對照組相比，整體mDP均顯著降低，說明溫度、時間及NaOH濃度都會影響mDP，可推測NaOH對PC可能有解聚的作用。但粗提液中含NaCl較多會堵塞液相色譜柱，因此后續檢測需進行除鹽處理。由圖2B可知，與粗提液相比，除鹽液的mDP穩定在1.2～2.5之間，十分接近。

2.2 NaOH處理條件對PC及體外活性的影響

2.2.1 液相色譜測定條件的優化

圖3 液相色譜條件優化Fig. 3 Optimization of mobile phase composition

目前用于葡萄籽PC檢測的方法有MonoChrom Diol[25]和Develosil Diol[16,26-28]。Develosil Diol能測DP 1～10及DP大于10的PC，MonoChrom Diol能測DP 1～5及DP大于5的PC，為更準確地表征PC，本研究采用Develosil Diol對PC的DP進行測定。首先進行單體和二聚體混合標準品檢測的優化，從圖3A可以看出，將乙腈-乙酸（98∶2，V/V）作為流動相條件下，在60 min出現一個非目標大峰，為減少非目標因素的干擾，對流動相進行優化，流動相改為乙腈-水（98∶2，V/V）；調整后的結果如圖3B所示，60 min大峰減小，說明干擾減小。在此基礎上，使用新的流動相體系對C、EC、ECG、原花青素二聚體B1、原花青素二聚體B2、原花青素二聚體B3、原花青素三聚體C1、原花青素四聚體A2單標和混標進行檢測，結果顯示，分子質量相同的單體混合僅出現一個峰；分子質量不同的混標，按照分子質量大小，分子質量小的先出峰，分子質量大的后出峰；混標各單體的出峰時間與單標的出峰時間有差異，但差異較小（圖3C～M）。這說明乙腈-水（98∶2，V/V）為較優的流動相，能夠用于后期葡萄籽OPC制備物的鑒定。

2.2.2 NP-HPLC測定OPC組分及OPC含量

圖4 樣品的NP-HPLC分析Fig. 4 NP-HPLC analysis of crude and desalted samples

圖5 堿處理樣品的液相色譜分析及OPC含量的變化Fig. 5 Effect of NaOH concentration on OPC contents as a function of pretreatment temperature

生物利用率研究顯示，OPC是被人體吸收的主要PC組分。因此，研究堿對PC的解聚效果需要重點分析產物中OPC含量的變化。依據DP小于5混標的出峰時間，可以對OPC的組分進行分析（圖3M）。圖4分別為60 ℃，15 min，NaOH濃度分別為0、1、2、4、6 mol/L粗提液和除鹽液的液相色譜圖，OPC的組成和含量有明顯的變化，其中粗提液中10～15 min出現了一個明顯的大峰（圖4A），但在除鹽液中卻沒有（圖4B），可以推測這個未知峰對應的化合物不溶于乙酸乙酯，可能是雜質，因此不再進一步分析。圖4B中25 min后基本沒有出峰，也說明除鹽后樣品中的主要PC為OPC。由圖5A～I可知，OPC各組分占比為單體＞二聚體＞ECG＞三聚體＞四聚體，四聚體較少。以下除特殊說明，對照組均為0 mol/L NaOH。

考察處理時間15、30、60 min對OPC組分的單峰面積、總峰面積、OPC含量的影響發現（圖5A～C），隨著時間的延長，對照組OPC組分的單峰面積、總峰面積、OPC含量變化不大，而實驗組OPC組分的單峰面積、總峰面積、OPC含量均呈減小趨勢。研究溫度40、60、80 ℃對OPC組分的單峰面積、總峰面積、OPC含量的影響發現（圖5A、D、G），隨著溫度的升高，對照組的OPC組分的單峰面積、總峰面積、OPC含量變化不大，實驗組除1 mol/L堿處理外，OPC組分的單峰面積、總峰面積、OPC含量均呈現增加趨勢，其中6 mol/L表現最優，而80 ℃結果最差。

NaOH濃度變化對OPC組分的單峰面積、總峰面積、OPC含量的影響顯示，與對照組相比，1 mol/L時單峰面積小于對照，大于1 mol/L時峰面積均大于對照，且隨著NaOH濃度的增加而增加；OPC組分的總峰面積及OPC含量的變化與單體峰面積變化相似，且進一步增加NaOH濃度仍有可能增加OPC組分、總峰面積及OPC含量（圖5）。

綜合處理時間、處理溫度、NaOH濃度3 個因素分析，當6 mol/L NaOH溶液處理15 min時，對比處理溫度40、60、80 ℃的數據發現，80 ℃和60 ℃較高，且80 ℃的OPC總峰面積和OPC含量高于60 ℃，依次分別為10 265 300.00f10 750.08，（72.96f2.60）μg/mL和9 878 310.00f15 417.32，（60.25f1.84） μg/mL，但60 ℃時有3 種PC：單體7 332 290.00f7 846.53、ECG 672 790.33f1 149.17和二聚體1 873 230.00f6 690.29，而80 ℃僅有2 種PC：單體8 023 860.00f7 010.10和二聚體2 241 460.00f4 675.69。蘇惠娟[29]嘗試4 種堿解聚PPC，解聚效果為氫氧化鈉＞碳酸鈉＞碳酸氫鈉≈碳酸氫鉀，最佳解聚條件為60 ℃、1 mol/L NaOH溶液處理25 min，得單體15.6 mg/g，二聚體20.1 mg/g，與本研究解聚產物相似。

2.2.3 NaOH處理樣品體外抗氧化活性

圖6 不同堿處理樣品的體外抗氧化活性及體外活性與PC含量的相關性分析Fig. 6 In vitro antioxidant activities of different alkali-treated samples and their correlation with PC content

由圖6所示，當溫度和時間一定時，與對照組相比，1 mol/L NaOH處理樣品的抗氧化活性小于對照，大于1 mol/L時活性均大于對照，且隨著NaOH濃度的增加而增加。當溫度和NaOH濃度一定時，活性隨著時間的延長而降低。當時間和NaOH濃度一定時，隨著溫度的變化，活性的變化無規律。6 mol/L NaOH處理15 min，對比不同溫度發現，DPPH、FRAP、ABTS抗氧化實驗結果均表現為60 ℃時活性最高，分別為（967.40f14.69）、（856.72f10.046 19）、（1 331.17f12.38） μmol/g。綜上分析，60 ℃條件下，6 mol/L NaOH處理15 min，獲得的OPC活性最高，OPC組成分析結果顯示，該條件下獲得OPC富含ECG組分（圖5D）。Zhang Shuting等[30]的研究結果與本研究相似，且其研究指出ECG的活性高于C和EC。故ECG組分含量較高可能是60 ℃、6 mol/L NaOH處理15 min后，OPC活性最大的原因。

2.2.4 最優堿處理條件

6 mol/L NaOH、60 ℃堿處理15 min時，OPC組分的總峰面積、OPC含量及體外抗氧化活性均呈增加趨勢（圖6），推測進一步增加NaOH濃度仍可以增加OPC組分的總峰面積、OPC含量及體外抗氧化活性。25 ℃時，飽和NaOH濃度為26.4 mol/L，因此進一步研究8、10、15、20、25 mol/L NaOH對PC解聚的影響。由圖7A可知，粗提液mDP在10 mol/L NaOH處理時降至最低，隨著NaOH濃度的增加又呈緩慢增加；而除鹽液的mDP較平穩地維持在1.29f0.019～2.51f0.017。圖7B～D顯示，除鹽液的OPC總峰面積與PC含量均在10 mol/L NaOH處理時達最大值，DPPH、FRAP、ABTS 3 種方法對于除鹽液抗氧化活性檢測均顯示在10 mol/L NaOH處理時達最高值。且PC含量與DPPH、FRAP、ABTS抗氧化活性均表現良好的線性關系。綜上，最佳預處理條件為60 ℃、15 min、10 mol/L NaOH。在此條件下，與對照組相比，mDP由5.39f0.12降至1.30f0.014，OPC組分的總面積增加了7.28 倍（單體8.09 倍，二聚體7.53 倍，三聚體4.66 倍），OPC含量增加了5.42 倍，體外抗氧化活性DPPH、FRAP、ABTS分別提高3.22、4.13 倍和2.84 倍。

圖7 NaOH濃度對PC的影響Fig. 7 Effect of different NaOH concentrations on mDP and total area and content of OPC and correlation between antioxidant activities and OPC content

2.2.5 堿處理對葡萄籽中PC釋放和解聚的規律

圖8 堿處理對PC解聚的影響Fig. 8 Effect of alkali treatment on depolymerization of procyanidins

依據2.2.4節分析NaOH濃度0～25 mol/L，60 ℃堿處理15 min對OPC組分及OPC含量的影響，發現堿對葡萄籽中的PC可能存在2 種作用：首先根據OPC含量先降低后增加的趨勢分析，堿可以促進OPC釋放。其次根據液相結果分析單體、ECG、二聚體、三聚體等對應的峰面積都有或多或少的增加，其中單體占比最高，增加最顯著，可以推測堿對PPC可能存在解聚作用。這與相關報道[31-32]的酚酸在植物中的2 種存在狀態（游離態和結合態）一致。隨著NaOH濃度提高，OPC含量先增加后減少的規律也支持本實驗推測的可能性（圖7B）。圖8A對NaOH濃度影響葡萄籽中游離和結合的OPC含量變化的機制進行了解釋：對照組沒有堿的作用，游離層的OPC可以被丙酮混合液提取。1 mol/L NaOH處理時，堿對結合層作用很小，不足以破壞其結構或與其成分發生反應，NaOH則會與部分游離層釋放的OPC反應破壞其結構。當2～10 mol/L NaOH處理時，隨著NaOH濃度的增加，結合層被逐漸破壞瓦解，隨著結構破壞的加劇更多的OPC被釋放，同時也有更多OPC與堿反應，但釋放大于損失。在10 mol/L NaOH處理時，釋放遠大于損失，故溶液中OPC最多。當10～25 mol/L NaOH處理時，結合層釋放的OPC在10 mol/L NaOH時已達到最大值，隨著NaOH濃度的增加，OPC損失加劇，損失逐漸大于最大釋放量，故溶液中能檢測到的OPC越來越少。0～25 mol/L NaOH，60 ℃處理15 min時檢測結果顯示，堿對OPC組分有明顯增加作用（圖7B）。進一步PPC堿處理，如圖8B所示，堿處理使60 min單峰變為在3～20 min的系列小峰，而圖3M顯示在此時間段內出現的單峰為單體、ECG、二聚體、三聚體，說明堿對PPC存在解聚作用，此結果與White等[11]的研究結果一致。上述這些結果說明了堿對葡萄籽中的OPC存在釋放和解聚制備2 種作用機制，二者的動態平衡顯示為最終OPC的產量。

3 結 論

通過探究不同NaOH濃度條件對葡萄籽PC的mDP、OPC組分、OPC含量以及體外抗氧化活性的影響，發現堿對于PC的釋放及解聚均有作用，并且得到了最優條件為60 ℃、15 min、10 mol/L NaOH處理。與對照組相比，優化處理條件下PC的mDP由5.39f0.12降至1.30f0.014，OPC組分的總面積增加7.28 倍（單體8.09 倍、二聚體7.53 倍、三聚體4.66 倍），OPC含量增加（5.42f0.56）倍，體外抗氧化活性DPPH、FRAP、ABTS分別提高3.22、4.13、2.84 倍。