HPLC-PDA法分析不同茶樹品種類胡蘿卜素香氣前體

陳 麗，坤吉瑞，王 靜，童華榮*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

茶葉中的類胡蘿卜素占干質(zhì)量的0.032%～0.125%[1]，不但可以作為色素影響干茶和葉底的色澤，還可在光合作用中起到光保護(hù)作用[2]，同時(shí)還參與茶葉香氣的形成，對(duì)茶葉品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)。類胡蘿卜素作為香氣前體降解產(chǎn)生的β-大馬烯酮、β-紫羅蘭酮、香葉醇、橙花叔醇、α-法呢烯等香氣物質(zhì)占成品茶香氣總量的4.3%～46.5%[3]，是茶葉香氣的重要組成部分。

目前分離檢測類胡蘿卜素的方法有柱色譜-分光光度法[4]、薄層色譜掃描定量法[5]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[6]。分光光度法定量不夠精確，薄層色譜法用混合溶劑作展開劑，經(jīng)單波長掃描定量，較前者有所改善，但檢測效率有待提高[7]。HPLC目前在茶葉中類胡蘿卜素的分析檢測中最為常用，但國內(nèi)用于檢測茶葉中類胡蘿卜素的方法大多存在提取程序繁瑣、檢測到的類胡蘿卜素種類少等問題[8-9]。Zapata等[10]建立的以C8反相色譜柱為基礎(chǔ)，并通過在流動(dòng)相中添加吡啶作為修飾劑改善峰形的二元梯度方法被認(rèn)為是目前分離效果最好、最有前途的一個(gè)色素分析方法。鄧春梅等[11]對(duì)該方法的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證，國際上對(duì)于其應(yīng)用日益增多[12-13]，但在國內(nèi)的茶學(xué)領(lǐng)域未得到應(yīng)用。

茶葉中類胡蘿卜素的種類和含量受茶葉成熟度、季節(jié)、加工工藝及茶樹品種等因素的影響。隨著茶樹葉片成熟度的增高類胡蘿卜素總量增高，而葉黃素與胡蘿卜素的比值卻有所下降[1,8]；在不同季節(jié)，茶葉中的類胡蘿卜素表現(xiàn)為夏季最高，春季最低，秋季介于二者之間[14]；茶葉加工過程中類胡蘿卜素的含量減少，一般情況下，烏龍茶因用成熟芽葉為原料，類胡蘿卜素含量最高，紅茶發(fā)酵引起類胡蘿卜素降解95%左右，含量最少，綠茶介于二者之間，較鮮葉減少80%以上[15]；有研究分析中國西南、江南、華南3 個(gè)產(chǎn)區(qū)的31 個(gè)茶樹品種的7 種類胡蘿卜，總量在324.8～528.8 μg/g之間，且遺傳因素對(duì)類胡蘿卜素的影響相對(duì)于栽培環(huán)境更大[9]。目前鮮見有關(guān)不同適制性茶樹品種中類胡蘿卜素的研究。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Zapata等[10]分析脂溶性色素的方法，分析37 個(gè)不同適制性茶樹品種的類胡蘿卜素，旨在闡明不同適制性茶樹品種中類胡蘿卜素的分布規(guī)律，為茶葉香氣的形成機(jī)理研究及茶葉加工中的品種選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

37 個(gè)不同適制性茶樹品種的一芽二葉均采于2017年秋季，其中僅適制綠茶的品種有15 種：巴渝特早（重慶南川）；中茶102、鄂茶1號(hào)、芙蓉6號(hào)（湖北恩施）；水晶茶、中白1號(hào)（四川宜賓）；碧香早、渝茶1號(hào)、渝茶2號(hào)、渝茶3號(hào)、南江1號(hào)、龍井長葉、烏牛早、中選10號(hào)、紫筍（重慶永川）。僅適制紅茶的品種有5 種：蜀永703、蜀永1號(hào)、蜀永2號(hào)、臺(tái)灣大葉（重慶永川）；云南大葉（重慶南川）。僅適制烏龍茶的品種有5 種：金萱、金匙（重慶永川）；九龍袍、紫牡丹、308（四川宜賓）。具有兼制性的品種有12 種：金牡丹（綠茶、烏龍茶，四川宜賓）；春蘭、梅占（綠茶、紅茶、烏龍茶，四川宜賓）；蜀永307、菊花春、勁峰、褚葉齊、福豐20號(hào)、浙農(nóng)117、崇批71-1（綠茶、紅茶，重慶永川）；大樹茶（綠茶、紅茶，重慶南川）；福鼎大白（綠茶、紅茶、白茶，重慶南川）[16-17]。鮮葉采下后立即放入液氮中處理，干冰低溫保護(hù)下運(yùn)輸，冷凍干燥固樣，磨碎后過40 目篩，-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

黃體素、玉米黃素、β-胡蘿卜素（均為標(biāo)準(zhǔn)品）上海源葉生物科技有限公司；丙酮、甲醇、乙腈、冰乙酸（均為HPLC級(jí)） 成都市科龍化工試劑廠；無水吡啶（HPLC級(jí)） 美國Aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

雷磁PHS-25 pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；5810R離心機(jī) 美國Eppendorf公司；M20A HPLC儀日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素的提取與HPLC分析條件

參考Zapata等[10]的方法。

1.3.2 類胡蘿卜素的定性定量

類胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)中所具有的發(fā)色團(tuán)使其在紫外-可見光區(qū)有著獨(dú)特的吸收區(qū)。目前，許多類胡蘿卜素的紫外-可見吸收光譜特征已被確定，如最特征吸收波長等。因此，利用類胡蘿卜素在紫外-可見光區(qū)的吸收光譜可對(duì)其進(jìn)行定性分析[18-19l。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]中類胡蘿卜素的特征吸收波長，結(jié)合Suzuki[20]、鄧春梅[11]等的保留時(shí)間確定各類胡蘿卜素的組分。

類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴且多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品在市場上沒有銷售，所以本實(shí)驗(yàn)僅使用3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。除玉米黃素和β-類胡蘿卜素根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)品定量外，其余各組分最大吸收波長與黃體素最為接近，均根據(jù)黃體素的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。各組分430 nm波長處均有一定強(qiáng)度的吸收峰，因此采用此波長條件下吸收峰的面積進(jìn)行定量計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取黃體素20.000 mg，玉米黃素25.000 mg，β-類胡蘿卜素25.000 mg，分別加10 mL二氯甲烷溶解，再加純的冰丙酮將黃體素稀釋成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，玉米黃素稀釋成0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 μg/mL，β-胡蘿卜素稀釋成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL 5 個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μL，繪制質(zhì)量濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 2.0進(jìn)行顯著性和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉類胡蘿卜素的定性分析

圖1 茶葉中類胡蘿卜素的HPLCFig. 1 HPLC analysis of carotenoids in tea leaves

對(duì)照文獻(xiàn)的保留時(shí)間和特征波長，共確定15 種類胡蘿卜素，與其他液相色譜檢測方法相比，此方法分離出了茶葉中更多的類胡蘿卜素組分，且玉米黃素與黃體素分離效果較好，如圖1所示。因自然界中類胡蘿卜素的種類繁多，且存在多種同分異構(gòu)體，本實(shí)驗(yàn)檢測到的幾種類胡蘿卜素組分特征吸收波長相近，因此其中9 種未能確定其具體結(jié)構(gòu)。確定結(jié)構(gòu)的6 種類胡蘿卜素分別為新黃素、堇黃素、環(huán)氧玉米黃素、玉米黃素、黃體素以及β-胡蘿卜素，如表1所示。

表1 類胡蘿卜素的特征吸收波長Table 1 Characteristic absorption wavelengths of carotenoids

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別測定玉米黃素、黃體素、β-胡蘿卜素3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度的峰面積，制作了質(zhì)量濃度與峰面積的一次標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 8，表明類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠，可準(zhǔn)確計(jì)算類胡蘿卜素的絕對(duì)含量。

表2 類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves for three carotenoids

2.3 類胡蘿卜素的測定結(jié)果

在被檢測的37 個(gè)鮮葉樣品中共同含有15 種類胡蘿卜素，總量在524.6～1 236.7 μg/g之間，平均為（863.7f13.5）μg/g，樣品間的差異十分顯著。從表3可以看出，37 個(gè)被測樣品所含類胡蘿卜素各組分的含量雖然各不相同，但總體呈現(xiàn)相同趨勢，即黃體素含量最高（（314.6f2.0）μg/g，36.42%），其次是堇黃素（（144.6f1.9）μg/g，16.74%）、新黃素（（102.4f1.7）μg/g，11.86%）、β-胡蘿卜素（（66.6f1.6）μg/g，7.71%）和玉米黃素（（56.3f1.2）μg/g，6.52%），這與Wei Xu等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

37 個(gè)品種中，適制烏龍茶的九龍袍和紫牡丹的黃體素含量較高，黃體素作為香氣前體，會(huì)酶促氧化生成茶螺烯酮，茶螺烯酮是烏龍茶中對(duì)果香有貢獻(xiàn)的重要香氣物質(zhì)[21]。適制紅茶的云南大葉，適制烏龍茶的金萱、金匙，綠茶、紅茶兼適制的蜀永307、勁峰中β-胡蘿卜素含量都超過100 μg/g，β-胡蘿卜素作為香氣前體降解得到的β-紫羅酮對(duì)綠茶、紅茶、烏龍茶甜香都有重要作用[22]。新黃素在綠茶、紅茶兼適制的梅占和大樹茶中含量最高，其酶解產(chǎn)生的β-大馬烯酮是紅茶茶湯的重要香氣成分[23]。綠茶、紅茶、白茶兼適制的福鼎大白類胡蘿卜素總量最高為（1 236.7f9.5）μg/g，其中玉米黃素占25.59%，已有實(shí)驗(yàn)表明擬南芥、玉米等植物中的玉米黃素會(huì)在酶催化下降解為具有番紅花香的藏花醛[24]，而藏花醛同樣在綠茶、紅茶、烏龍茶及普洱中檢出[3,25]，說明茶葉中的藏花醛也可能由玉米黃素降解得到。總含量大于1 000 μg/g的茶樹品種還有云南大葉（1 214.5 μg/g）、金萱（1 082.3 μg/g）、九龍袍（1 105.1 μg/g）、紫牡丹（1 114.6 μg/g）、308（1 003.2 μg/g）和梅占（1 068.4 μg/g），這些品種也可能加工成為高香型茶。

不同適制性的各類茶樹品種所含類胡蘿卜素各組分的平均值如表4所示，含量較高的組分中，除綠茶品種和紅茶品種的黃體素和β-胡蘿卜素?zé)o顯著性差異外，4 種適制性品種的新黃素、堇黃素、環(huán)氧玉米黃素和玉米黃素均有顯著性差異。各類品種的類胡蘿卜素總量也存在顯著性差異，烏龍茶品種的平均總量最高（（1 046.0f13.9） μg/g），其次是紅茶（（889.4f12.8）μg/g ），綠茶含量最低（（801.0f12.8））μg/g。

表3 37 個(gè)茶樹品種中的類胡蘿卜素含量Table 3 Kinds and amounts of carotenoids in 37 tea varieties

表4 不同適制性茶樹品種類胡蘿卜素含量Table 4 Carotenoid contents of tea leaves for different tea varieties

2.4 PCA結(jié)果

采用PCA法對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以闡明樣品類胡蘿卜素組分及含量的內(nèi)在規(guī)律[26]。15 種類胡蘿卜素和37 個(gè)品種組成15h37的矩陣分析結(jié)果如下：抽樣適合性檢驗(yàn)值為0.637，P值為0，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)適合進(jìn)行PCA。從表5可以看出，前4 種主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到82.919%，表明前4 個(gè)主成分能夠基本解釋37 個(gè)品種類胡蘿卜素類香氣前體的全部變量信息。

表5 主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

表6 前4 個(gè)主成分的載荷量Table 6 Loading capacities of fi rst four principal components

從表6可知，對(duì)PC1貢獻(xiàn)較大的類胡蘿卜素包括黃體素、堇黃素、新黃素、C9、C13和β-胡蘿卜素等，這些是樣品中含量較高的組分；對(duì)PC2貢獻(xiàn)較大的是玉米黃素和環(huán)氧玉米黃素；在PC3有較大正載荷量的是C14、C2和C10；對(duì)PC4貢獻(xiàn)較大的是C6和C7。

PC1和PC2累計(jì)貢獻(xiàn)率最高的2 個(gè)主成分，37 個(gè)品種根據(jù)圖2中各樣品的相對(duì)位置，可以分析樣品間的差異。相對(duì)位置越近，差異越小[27]。

如圖2所示，37 個(gè)品種可以分為3 部分，PC1得分較高的5 個(gè)烏龍茶品種聚在圖右側(cè)，說明烏龍茶品種類胡蘿卜素含量明顯優(yōu)于其他品種。黃體素酶促氧化可降解為花果香的茶螺烯酮；新黃素酶促氧化降解為玫瑰花香，李、柚等果香的β-大馬烯酮；β-胡蘿卜素可在物理、生物途徑降解產(chǎn)生β-紫羅酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、橙花叔醇和香葉基丙酮等多種香氣物質(zhì)。這可能是烏龍茶花果香濃郁，香氣物質(zhì)含量豐富的原因。圖2上方分布著適制紅茶的蜀永703、蜀永2號(hào)、臺(tái)灣大葉、云南大葉和具有兼制性的福鼎大白，分布較為分散，說明玉米黃素和環(huán)氧玉米黃素對(duì)紅茶的影響較大。玉米黃素、環(huán)氧玉米黃素參與葉黃素循環(huán)，二者之間根據(jù)光照情況可相互轉(zhuǎn)化[28]，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶可催化玉米黃素降解為3-羥基-β-紫羅酮[29]，紅茶加工過程中也有該香氣物質(zhì)的形成，但其轉(zhuǎn)化機(jī)理尚不明確[24]。其余27 個(gè)品種密集分布在X軸附近成為另外一類，它們?cè)赑C1和PC2上的得分均不高，說明其類胡蘿卜素含量較低。

圖2 37 個(gè)品種主成分得分圖Fig. 2 Scores plot of PC1 versus PC2 for 37 tea varieties

從圖2可以看出，福鼎大白和云南大葉是2 個(gè)較為特殊的品種。福鼎大白在PC2上有很高的得分，而在PC1上得分為負(fù)，原因是其含有很高的玉米黃素造成的。類胡蘿卜素不但可以作為香氣前體對(duì)茶葉香氣有貢獻(xiàn)，也有利于紅茶紅湯紅葉品質(zhì)特征的形成，紅茶品種云南大葉在PC1和PC2上均有較高得分，說明其類胡蘿卜素含量最為豐富，對(duì)香氣和色澤品質(zhì)都有積極作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用的HPLC-二極管陣列檢測器法與國內(nèi)其他分析茶葉中類胡蘿卜素的方法比較，具有操作簡便、快速、所需標(biāo)準(zhǔn)品少的特點(diǎn)。在37 個(gè)茶樹品種中共檢測到15 種類胡蘿卜素，含量為524.6～1 236.7 μg/g，平均為（863.7f13.5）μg/g，檢測結(jié)果更為全面。通過PCA得出，不同適制性茶樹品種所含類胡蘿卜素存在較大差異，烏龍茶的類胡蘿卜素含量最高；紅茶的環(huán)氧玉米黃素和玉米黃素含量高，其他品種類胡蘿卜素含量低。為不同茶類的香氣形成機(jī)理研究及茶葉加工中的品種選擇提供理論依據(jù)。

但本實(shí)驗(yàn)采用的檢測方法未檢測出番茄紅素、六氫番茄紅素等對(duì)茶葉香氣同樣具有重要貢獻(xiàn)的類胡蘿卜素，這些類胡蘿卜素在茶葉中含量較少，可在本實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)上加大樣品量，延長檢測時(shí)間，或使用大氣壓化學(xué)電離離子源的質(zhì)譜[30]等手段進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)檢測出的類胡蘿卜素中，一些組分結(jié)構(gòu)尚不明確，需要通過HPLC-MS/MS聯(lián)用、核磁共振、紅外光譜等檢測手段分析。后續(xù)關(guān)于類胡蘿卜素香氣前體的研究可進(jìn)一步擴(kuò)展到加工過程及成品茶中，并結(jié)合香氣物質(zhì)進(jìn)行研究，有利于研究類胡蘿卜素在茶葉中的降解機(jī)理，為茶葉加工提供參考。