基于脂質組學法對母乳、牛乳及羊乳脂質的差異分析

張宏達，王立娜，張 宇，李曉東,*，冷友斌，鞏燕妮，蔣士龍

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江飛鶴乳業有限公司，黑龍江 哈爾濱 150030；4.黑龍江完達山林海液奶有限公司，黑龍江 牡丹江 157100）

母乳中的脂質是嬰兒最重要的營養物質來源之一，其主要包括甘油三酯（triglyceride，TG）、甘油二酯（diglyceride，DG）、游離脂肪酸、膽固醇等中性脂質和甘油磷脂、鞘脂、糖脂等極性脂質[1]，它們不僅在嬰兒出生的前6 個月中為嬰兒提供其所需的40%～50%的能量[2]，還是參與嬰幼兒腦部、視力發育及器官快速生長和生物膜合成的重要營養成分[3-5]。母乳作為嬰兒出生前6 個月中全部營養物質的來源，可以滿足嬰幼兒生長發育的全部脂類需求，但可能由于母親身體健康狀況等原因，母乳喂養并不能完全實現。為使作為母乳替代品的嬰幼兒配方奶粉達到與母乳盡可能相似的生理功能，對母乳及其替代品原料的脂質組分進行完整分析具有重要意義。

脂質組學是一門對生物體系脂質進行全面系統分析的研究學科[6]，利用先進儀器設備實現對給定基質中存在的脂質進行快速、高通量的分析鑒定是其重要研究內容之一。雖然脂質組學在生物學研究中的應用呈指數增長，但其在乳脂質研究方面仍處于起步階段[7]。多年以來，薄層色譜、氣相色譜等基礎分析手段都已經被用于研究乳脂質組成[8-9]，而近期隨著色譜與質譜、核磁共振譜聯用等分析技術的發展，為乳脂質組學的研究提供了更加多樣且可靠的技術手段。迄今為止，具有高分辨率和高通量特性的液相色譜-質譜聯用法已經成為脂質組學分析中最常用的技術手段[1]。Beccaria等[10]開發了一種利用液相色譜-質譜聯用技術高效檢定乳中TG的方法，并對母乳、牛乳及羊乳的TG組成進行了分析，分別鑒定出了136、165 種及141 種TG。Kallio等[11]利用超高效液相色譜-質譜聯用法對中國和芬蘭地區母乳中TG組分進行了分析，共檢出了300余種TG結構；何楊波等[12]利用超高效液相色譜-串聯三重四極桿飛行時間質譜法對中國東北地區母乳磷脂的組成進行了分析，從母乳中檢出磷脂共計60 種。雖然目前對于母乳及其他乳的脂質成分測定的研究已經有所進展，但大多數研究都是針對單一脂質種類進行的，對母乳及其他乳類進行的全脂質研究十分稀少且方法陳舊[13-14]，更鮮有從組學層面進行的全脂質組分研究。這使得目前關于母乳及一些作為母乳替代品的脂質組成研究非常分散，難以形成描述母乳及其替代品脂質組成的完整體系。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupoletime of flight-mass spectrum，UPLC-QTOF-MS）聯用技術，對母乳、牛乳及羊乳的脂質組成進行表征，并通過單變量統計分析手段分析3 種乳中脂質組成差異，以期為豐富中國母乳數據庫提供數據支撐，為嬰幼兒配方奶粉脂質母乳化及乳脂質組學的進一步發展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳采集自吉林省松原市的成熟健康母乳（（30f1）d），年齡20～25 歲，分娩健康足月兒，母乳充足，哺乳期間不吸煙、不飲酒，孕期或哺乳期間無乳腺炎、感染性疾病、心血管疾病、代謝性疾病、精神系統疾病、癌癥及其他惡性消耗性疾病，最近2 周沒有使用過藥物及催乳用西藥，并填寫知情通知書；牛乳及羊乳采集自黑龍江省五常市。樣品采集后分裝在已編碼的10 mL凍存管中，于—20 ℃冰箱中保存，直至使用。

1-十五烷酰基-2-油酰基(D7)磷脂酰乙醇胺（1-pentadecanoyl-2-oleoyl(D7)-sn-glycero-3-phosphoethanolamin，D7-PE）、1-油酰基(D7)-2-羥基磷脂酰膽堿（1-oleoyl(D7)-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine，D7-LPC）、1,3-二十五烷酰基-2-油酰基(D7)甘油三酯（1,3-dipentadecanoyl-2-oleyol(D7)-glycerol，D7-TG）標準品 美國Avanti 公司；甲醇、甲基叔丁基醚、乙腈（均為色譜純） 德國CNW Technologies公司；醋酸銨、氨水、二氯甲烷、異丙醇（均為色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

1290 UPLC儀 美國Agilent公司；Triple TOF 6600型高分辨質譜（配備Analyst TF 1.7控制軟件） 美國AB Sciex公司；Heraeus Fresco17冷凍微量離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；超聲儀 深圳雷德邦電子有限公司；超純水系統 德國Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

分別取母乳、牛乳及羊乳乳樣各6 份，進行脂質提取；通過UPLC-QTOF-MS方法對3 種乳中脂質種類及含量進行測定后，對3 種乳中脂質組成進行差異分析。

1.3.2 樣品處理

脂肪提取：取60 μL樣品，加入340 μL H2O，加960 μL 5∶1（V/V）的甲基叔丁基醚-甲醇（含10 μL 10 μg/mL D7-PE（15∶0/18∶1），5 μL 100 μg/mL D7-L P C（1 8∶1），1 1 μ L 1 0 0 μ g/m L D7-T G（15∶0/18∶1/15∶0））；渦旋振蕩60 s，超聲處理10 min；4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液500 μL；重新加入500 μL甲基叔丁基醚，重復提取2 次，合并3 次上清液，在旋轉蒸發儀下吹干；吹干后樣品用100 μL 1∶1（V/V）的二氯甲烷/甲醇復溶；取60 μL上清液于2 mL進樣瓶，上機檢測[15]。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Phenomen Kinetex 1.7u C18100A Column（100 mmh2.1 mm）；流動相A：10 mmol/L醋酸銨+40% H2O+60%乙腈；流動相B：10 mmol/L醋酸銨+10%乙腈+90%異丙醇；流速300 μL/min。洗脫條件：0～12 min，60% A；12～13.7 min，0% A；13.7～18 min，60% A；進樣量2 μL[16]。

1.3.4 質譜條件

在控制軟件控制下基于IDA功能進行一級、二級質譜數據采集。在每個數據采集循環中，采集強度最強且大于100的分子離子對應的二級質譜數據。轟擊能量：35 eV，每50 ms采集15 張二級譜圖。電噴霧離子源參數設置為：霧化氣壓（GS1）60 Pa；輔助氣壓60 Pa；氣簾氣壓30 Pa，溫度550 ℃；噴霧電壓5 500 V[16]。

1.4 數據處理

使用ProteoWizard軟件將原始質譜轉化為mzXML格式。再使用XCMS軟件進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作。使用基于XCMS軟件、R程序包及脂質二級數據庫進行脂質鑒定及定量工作；使用SPSS 23.0和Simca 14.1軟件對數據進行差異分析和單變量統計分析。

2 結果與分析

2.1 母乳、牛乳及羊乳脂質組成

圖1為母乳、牛乳及羊乳基于UHPLC-QTOF-MS法在正離子模式下掃描得到的總離子流圖譜，表1為在3 種乳中鑒定出的脂質種類及含量。如表1所示，本研究從3 種乳中均檢出脂質103 種，其中包括磷脂酰膽堿（phosphatidylcholines，PC）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、神經酰胺（ceramide，Cer）及己糖苷神經酰胺（hexosylceramides，HexCer）4 類極性脂質和TG、DG 2 類中性脂質。但脂質中常見的其他3 類極性脂質磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸在本研究中未檢測到。這可能是由這些極性脂質分子在離子化時所帶電荷導致的[17]。

圖1 母乳（a）、牛乳（b）及羊乳（c）總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of human (a), bovine (b)and caprine milk (c)

表1 母乳、牛乳及羊乳中脂質種類及含量（n＝6）Table 1 Types and concentrations of lipids identi fi ed in human,bovine and caprine milk (n= 6)

續表1

2.2 母乳、牛乳及羊乳極性脂質差異分析

如圖2所示，母乳含量最高極性脂質種類是SM（468.82 μg/mL），其次是Cer（422.98 μg/mL），而后則是PC（62.587 μg/mL）與HexCer（22.57 μg/mL），母乳中高含量的SM已經被一些研究證實，但關于母乳中Cer的高含量研究很少[18-19]，Cer既是合成SM的前體也是SM的分解產物[20]，二者在母乳中的高含量可能存在對應關系。在母乳不同的脂質類別中（表1），PC主要與飽和脂肪酸相連，其中PC（P-20∶0/18∶0）、PC（P-20∶0/20∶0）是含量最高的PC種類，共占母乳PC含量的58%，這與Yao Yunping等[19]的結論有所出入，可能是由于含不飽和脂肪酸的PC在離子化時主要以陰離子形式存在導致的；母乳中的主要Cer則是Cer（d18∶1/22∶0）、Cer（d18∶1/24∶1）和Cer（d18∶1/24∶0），母乳總Cer約61%；母乳中含量最高的SM種類為SM（d16∶0/26∶1），質量濃度高達317.2 μg/mL，占母乳總SM含量的67%，其次為SM（d14∶1/26∶1），含量為44.98 μg/mL；此外，本研究鑒定出的母乳中3 種HexCer里，HexCer（d17∶0/24∶1）和HexCer（d18∶1/16∶0）是其中的主要HexCer種類。

圖2 母乳、牛乳及羊乳中各類極性脂質總質量濃度Fig. 2 Total contents of different classes of polar lipids in human,bovine and caprine

與母乳相似的是，牛乳極性脂質質量濃度同樣遵循SM（22.46 μg/mL）＞Cer（12.46 μg/mL）＞PC（5.42 μg/mL）＞HexCer（5.06 μg/mL）的趨勢。具體種類中，PC（P-20∶0/18∶0）、PC（P-20∶0/20∶0）及PC（P-20∶0/9∶0）是牛乳中主要的PC種類，占牛乳中PC的54%；Cer（d18∶1/16∶0）及Cer（d18∶1/22∶0）則是牛乳中主要的Cer種類；牛乳中主要SM種類為SM（d15∶0/24∶1）、SM（d14∶0/20∶0）及SM（d14∶0/18∶1），共占牛乳中SM的54%；牛乳中含量最高的HexCer種類則與母乳相同，為HexCer（d17∶0/24∶1）和HexCer（d18∶1/16∶0）。

與母乳及牛乳不同，在羊乳中Cer（625.91 μg/mL）是含量最高的極性脂質種類，其次為SM（555.93 μg/mL）和H e x C e r（1 7 5.5 1 μ g/m L），而P C含量最低（105.65 μg/mL），這一結果與Castro等[21]的研究結果有所差異，可能與羊品種及飼喂方式有關。羊乳中PC（P-20∶0/18∶0）、PC（P-16∶0/2∶0）及PC（P-20∶0/9∶0）3 種PC的含量遠高于其他種類PC，C20:0、C16:0及C18:0是其含量最高的3 種脂肪酸；Cer（d18∶1/16∶0）是羊乳中含量最高的Cer類型，占其總Cer的47%；羊乳中主要SM種類則為SM（d16∶0/26∶1）、SM（d15∶0/24∶1）和SM（d14∶0/18∶1），共占羊乳中SM的48%；羊乳中HexCer種類同樣以HexCer（d17∶0/24∶1）和HexCer（d18∶1/16∶0）為主，占羊乳中HexCer的98%以上。

對比3 種乳中極性脂質含量可以發現，母乳中極性脂質含量低于羊乳，而顯著高于牛乳（P＜0.05），與其他研究中結論有所出入，這與牛乳產地差異或飼料差異有關[17-18]。另外，母乳中SM連接的超長鏈脂肪酸比例遠高于牛乳及羊乳。包含超長鏈脂肪酸的SM是構成脂肪球膜上脂閥結構的主要物質，這種特殊結構構成了微生物、細菌、病毒的特定黏附位點，是乳脂肪球膜的殺菌功能的重要來源[22]，母乳中高含量的超長鏈脂肪酸SM可能意味著母乳脂肪球在抗菌功能上強于牛乳和羊乳。

對不同乳的極性脂質進行單變量統計分析，篩選變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP，表示每個物質對差異所起的貢獻值）大于1、P值小于0.05的脂質為2 種乳間差異脂質，結果見表2。發現牛乳與母乳間具有顯著差異的極性脂質共有11 種，主要為SM類，其中SM（d14∶0/20∶0）與SM（d15∶0/24∶1）2 種在母乳中含量較高且差異最為顯著。此外牛乳在3 種HexCer上與母乳間都存在顯著差異（VIP＞1，P＜0.05），而研究表明HexCer是生物體各種膜結構的重要組分，在細胞表面發生的跨膜信號轉導中起重要作用[23]，這一作用與人體免疫應答、細胞發育、細胞識別及分化有著重要關聯[24]，因此，在以牛乳為基料制備嬰幼兒配方奶粉時，對HexCer成分的調整可能會具有重要意義。羊乳與母乳間存在顯著差異的極性脂質只有PC（26∶0/0∶0）一種，而牛乳與羊乳在磷脂方面不存在顯著差異種類。整體來看，在極性脂質組成方面，羊乳與母乳間差異較牛乳與母乳間更小，更適合用于生產母乳替代品。

表2 母乳、牛乳及羊乳中具有顯著差異的極性脂質種類Table 2 Polar lipids that significantly differed among human,bovine and caprine milk

2.3 母乳、牛乳及羊乳中性脂質差異分析

如圖3所示，母乳中DG含量與其他組分相比相對較高（38 405.11 μg/mL），甚至高于母乳中TG含量（9 344.29 μg/mL），該結果與早期研究存在一定差異，本研究中所用方法檢測到的DG種類遠多于其他研究，而TG種類相對較少。這可能是導致結果存在差異的主要原因[25-26]。由表1可知3 種乳中中性脂質的具體組成情況，DG（18∶2/18∶2）是母乳中含量最高的DG種類，質量濃度高達18 552.24 μg/mL，占母乳中DG的48%；TG（16∶0/18∶1/18∶2）、TG（16∶0/18∶0/18∶1）、TG（18∶1/18∶2/18∶2）則是母乳中主要的TG種類，共占母乳TG的65%。牛乳中，TG質量濃度（9 236.37 μg/mL）則遠高于DG（386.54 μg/mL），主要DG種類為DG（16∶0/16∶0）、DG（18∶1/18∶1），二者共占牛乳中DG含量的46%，牛乳TG中則是TG（16∶0/18∶0/18∶1）質量濃度最高（3 263.08 μg/mL）。羊乳DG質量濃度（5 043.48 μg/mL）則與TG相對接近（6 284.82 μg/mL），其中DG（18∶1/18∶1）約占羊乳DG總量的40%，而TG（16∶0/18∶0/18∶1）則約占羊乳TG含量的34%。通過對比可以看出，母乳中DG含量顯著高于牛乳及羊乳（P＜0.05），這可能是致使母乳喂養嬰兒肥胖率相對較低的原因之一[27-28]。

圖3 母乳、牛乳及羊乳中中性脂質總質量濃度Fig. 3 Total contents of different classes of neutral lipids in human,bovine and caprine milk

通過單變量統計分析，篩選3 種乳中具有顯著差異（VIP＞1，P＜0.05）的中性脂質種類，結果見表3。其中牛乳與母乳間具有顯著差異的脂質種類最多，包括12 種DG和13 種TG，而羊乳中與母乳具有顯著差異的DG只有DG（20∶2/20∶2），TG則有12 種；牛乳與羊乳的中性脂質組成相對接近，僅有3 種TG存在顯著差異（VIP＞1，P＜0.05）。可以看出，牛羊乳與母乳存在顯著性差異的中性脂質主要為TG，且TG（17∶2/18∶0/20∶5）在3 種乳中都存在顯著性差異（VIP＞1，P＜0.05）。此外，牛乳和羊乳在TG（12∶0/12∶0/16∶1）、TG（12∶0/12∶0/16∶0）、TG（12∶0/18∶1/16∶1）3 種中鏈脂肪酸甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT）上都與母乳存在顯著差異（VIP＞1，P＜0.05）。MCT較容易被人體吸收且對改善糖、脂、膽固醇代謝有一定積極作用[29-30]，牛乳及羊乳在MCT上與母乳的差異可能會對嬰幼兒生長發育具有潛在的影響。此外，母乳中含有亞油酸（C18:2）的DG和TG含量顯著高于牛乳和羊乳（P＜0.05），這一趨勢與母乳中亞油酸含量遠高于牛乳及羊乳的趨勢相似[31]。而亞油酸在嬰兒視力、智力發育、預防過敏等方面具有重要作用[32]，牛乳與羊乳在亞油酸上與母乳的巨大差異是十分值得注意的。

表3 母乳、牛乳及羊乳中具有顯著差異的中性脂質種類Table 3 Neutral lipids that significantly differed among human,bovine and caprine milk

3 結 論

通過母乳、牛乳及羊乳脂質組成的全面定性定量分析發現，牛乳與母乳間具有顯著性差異的脂質種類多達36 種，主要集中在TG、DG和SM；而羊乳與母乳間具有顯著差異的脂質種類相對較少，為14 種，主要集中在TG。母乳中的主要極性脂質為SM，且SM（d14∶0/20∶0）與SM（d15∶0/24∶1）含量顯著高于牛乳，而與羊乳無顯著差異；此外牛乳HexCer與母乳存在顯著差異，對嬰兒免疫應答及發育具有潛在影響；中性脂質方面，母乳中DG含量顯著高于牛羊乳（P＜0.05），這種差異對減少嬰兒肥胖的發生有一定作用。從脂質組成角度來看，羊乳與母乳間的差異比牛乳與母乳更小。本研究揭示了母乳、牛乳和羊乳脂質組成和差異情況，豐富了我國母乳研究數據，并為嬰幼兒配方奶粉中脂質的優化和調整提供了更多參考依據。