表面等離子體共振免疫傳感器檢測喹乙醇

謝春花，柳 雙，王敏思，王霞琳，王 珅，張志軍，宋 洋,*

（1.天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；2.國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津），天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384）

喹乙醇（olaquindox，OLA）是一種化學合成的生長促進劑而不是抗生素藥物，可促進機體蛋白質合成代謝，提高飼料能量利用率，因此加快了生長發育，提高了個體瘦肉率[1-3]。盡管當時缺乏毒性和潛在機制的證據，OLA仍被廣泛用作豬的飼料添加劑，以提高飼料轉化效率[4-6]。近年來，在水產飼料中，OLA曾被稱為“水產養殖瘦肉精”[7-8]。研究表明，大劑量的OLA可對動物產生毒性作用，并且OLA在體內累積，當在動物體內積累到一定程度時，會對動物和人類造成致畸、致癌和致突變作用。然而，該藥物的毒性根據動物的種類不同變化很大。OLA對家禽和魚類具有顯著的毒性[9]和特定的遺傳毒性[10]。因此，歐盟自1999年以來完全禁止使用OLA[11-12]。2018年1月11日，農業部第2638號公告公布，自2018年5月1日起，限制使用OLA[13]。澳大利亞允許豬和禽肉中OLA的最大殘留限量為300 μg/kg[14]。在日本，豬肉、雞肉和其他動物的OLA最大殘留限量控制在300 μg/kg之內。

目前表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術被廣泛用于食品安全檢測。Karczmarczyk等[15]研究了一種基于競爭性免疫測定的策略，使用與酶（堿性磷酸酶）結合的二抗作為標記，改良的金絲網印刷電極（screen-printed gold electrode，AuSPE）對霉菌毒素（赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素M1）進行伏安檢測，檢出限到μg/L級別。Amjadi等[16]建立了基于銀納米棱柱（Ag nanoprisms，AgNPRs）的形態轉化開發了一種靈敏的比色探針檢測超痕量Se（IV），檢出限為1.2 μg/L。該方法用于水和食品樣品的分析。Song Yang等[17]使用PH-BSA固定的傳感器芯片的SPR免疫測量蘋果、桃子、卷心菜等樣品中的亞胺硫磷殘留量，樣品的最低檢出限為1.6 ng/L。趙芳等[18]采用表面自組裝技術在金膜的表面修飾羧基基團，將玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）抗原與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）偶聯物（ZENBSA）通過共價鍵固定在芯片的表面，采用競爭法檢測樣品中的玉米赤霉烯酮毒素，檢出限為8.2 μg/L。Pan Mingfei等[19]基于抑制形式制備了可重復的SPR免疫傳感器，用于穩定和靈敏地檢測動物源性食品中的4 種磺胺類藥物，對純牛奶、雞蛋、雞肉、牛肉與魚樣品進行檢測，檢測周期可在不到5 min內完成，每個SPR芯片可重復使用300 個分析周期。Zhang Lili等[20]以4-乙烯基苯硼酸為功能單體，聚乙二醇丙烯酸酯和2,2’-偶氮異丁基脒鹽酸鹽為交聯劑和引發劑，制備了卡那霉素分子印跡SPR傳感器對奶粉和蜂蜜中的卡那霉素進行檢測。與非印跡傳感器相比，印跡傳感器對卡那霉素具有更好的印跡效果和選擇性。潘明飛等[21]針對花生中高毒污染物黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1），開發一種可再生循環使用的抑制型SPR免疫傳感器。該實驗檢出限（IC15）為0.004 9 μg/L，靈敏度（IC50）達到0.025 μg/L；對花生樣品中AFB1的檢出限（IC15）和靈敏度（IC50）分別達到0.13 μg/kg和0.74 μg/kg。

用于檢測OLA免疫分析方法研究[22-24]有很多。Zhao Dan等[25]開發了用于測定動物飼料樣品中OLA的高靈敏度和特異性間接競爭性酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。OLA由N’N-羰基二咪唑激活并與BSA和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）偶聯。發現兩種抗血清的靈敏度和特異性非常相似，IC50值分別為16 ng/mL和19 ng/mL。Zhao Dongyan等[26]通過使用親水性分子印跡薄膜引入了一種替代生物抗體的新方法，開發了一種快速、新型的直接競爭仿生ELISA法測定雛雞飼料中的OLA。在最佳條件下，靈敏度（IC50）和檢出限（IC15）分別為（700f60）μg/L和（17.0f1.6）μg/L。Le Tao等[27]開發了免疫色譜（immunochromatography，ICG）條帶，用于同時定量測定動物飼料中的5 種喹喔啉-1,4-二氧化物。為此目的，將具有基團特異性喹喔啉-1,4-二氧化物的多克隆抗體（PcAb）與膠體金顆粒綴合，作為ICG條帶的檢測試劑以測試喹喔啉-1,4-二氧化物。該方法在5～10 min內實現了喹喔啉-1,4-二氧化物的半定量檢測。喹烯酮、喹賽多、卡巴氧、痢菌凈和OLA條帶的視覺下檢出限分別為10、15、15、20 ng/mL和20 ng/mL。使用ICG條帶讀數器，對于喹烯酮、喹賽多、卡巴氧、痢菌凈和OLA，分別計算IC50為9.1、13.5、16.6、20.2 ng/mL和21.3 ng/mL。Pei Xingyao等[28]建立了一種簡單、快速、超靈敏、定量的金免疫層析法，用于分析動物飼料樣品和地表水樣品中的OLA，優化方法的IC50為飼料3.35 μg/L，環境水0.35 μg/L。Peng Tao等[29]基于熒光微球的ICG法已被建立用于同時檢測環境水和動物食品中的5 種經典喹喔啉。在最佳條件下，它在15 min內實現了對5 種喹喔啉的定性和定量檢測。環境水和動物食品中5 種喹喔啉的目測檢出限分別為5～15 μg/L和100～250 μg/kg。

本實驗擬建立一種基于SPR的免疫傳感器，用于高效靈敏地檢測動物飼料和水產養殖水中的OLA?；谌乖酒腟PR免疫傳感器，并對實際樣品進行測定。此外，針對芯片的壽命，對同源的單、多克隆OLA抗體結合芯片的穩定性進行比較。該實驗可為實際樣品中OLA的檢測提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飼料樣品 天津市購；水樣由天津市多個飼養池采集。

OLA（純度99%）、喹烯酮（純度99.6%）、卡巴多（純度98.8%）、鹽酸克倫特羅（純度98%）、氯霉素（純度99.9%） 美國Sigma Aldrich公司；乙酰甲喹（純度97%） 加拿大TRC公司；1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基-琥珀酰亞胺（N-hydroxy-succinimide，NHS）、1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亞胺（ethanolamine, 1-ethyl-3-(3-(di methylamino)propyl) carbodiimide，EDC）、乙醇胺（ethanolamine，EA）、10 mmol/L乙酸鹽、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、甘氨酸（Gly）-HCl（10 mmol/L）、HCl、NaOH Harmonia Testing Technology天津股份有限公司。用PBS制備1.0h102mg/L OLA儲備溶液并在25 ℃貯存。其他用甲醇稀釋至500 mg/L的結構類似物，在4 ℃貯存。

OLA-OVA質量濃度為5.0 mg/mL，抗OLA抗體（單克隆和多克隆抗體）質量濃度均為4.3 mg/mL，由天津師范大學動植物抗性重點實驗室制備。

1.2 儀器與設備

BIAcore 3000 SPR儀 美國GE公司；羧甲基化葡聚糖CM5芯片 德國Xantec公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Thermo Finnegan公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

將處理過的CM5芯片放入SPR儀器中。在基線穩定后，使用10 mmol/L PBS作為運行緩沖液。將NHS和EDC混合物注入儀器中以激活CM5芯片表面上的葡聚糖，注入OLA-OVA進行抗原的固定化。CM5芯片表面的葡聚糖活化后暴露出大量的羧基可以與OLA-OVA蛋白的氨基形成肽鍵，從而使OLA-OVA固定于芯片表面，用EA溶液封閉未結合的羧基位點?？瞻淄ǖ酪沧鱿鄳奶幚怼．斈繕丝贵w流過芯片表面時，抗體將特異性地與OLA-OVA結合，每次結合后用適合的再生液再生，再生液可以將結合的抗體與抗原斷開，記錄結合抗體后SPR信號的變化。流程如圖1所示。

圖1 SPR免疫傳感器實驗原理Fig. 1 Schematic demonstration of the principle of the SPR immunosensor

1.3.2 SPR方法建立

1.3.2.1 預富集與抗原固定

在激活芯片之前，進行預富集實驗以確定OLA-OVA稀釋劑的pH值和質量濃度，以提高偶聯效率并降低配體消耗。原理參考Lu Yang等[30]。預富集可以確定抗原OLAOVA的最佳質量濃度和pH值條件。在該實驗中，分別用pH 5.0、4.5和4.0的乙酸鈉緩沖液將OLA-OVA稀釋200、100、50、25 倍和10 倍。PBS作為運行緩沖液，流速為10 μL/min，分別將不同的處理抗原以每次10 μL的體積注入反應池中，每次反應后，用50 mmol/L NaOH溶液進行沖洗，觀察響應值，確定抗原稀釋液pH值及質量濃度。

EDC/NHS混合注入70 μL，活化芯片表面，將預富集選好的最適抗原質量濃度及pH值的抗原固定于芯片表面，PBS為運行緩沖液，流速10 μL/min，每次注入10 μL，根據固定的效果決定抗原固定量，用70 μL的EA封閉未偶聯抗原的羧基，穩定基線10 min。

1.3.2.2 結合實驗

使用10 mmol/L PBS作為運行緩沖液。將抗體分別稀釋1 000、800、600、400 倍和200 倍，設置流速為20 μL/min，注射量為60 μL，解離時間為300 s，注入儀器與芯片表面的OLA-OVA進行結合。通過響應值判斷結合程度，從而確定抗體的最佳質量濃度。每個質量濃度進行3 次注射，每次結合后用再生溶液進行再生，同時選擇最佳再生溶液。在相同條件下，在注射抗體之前注射PBS作為對照組。

1.3.2.3 競爭實驗

用PBS稀釋OLA，使質量濃度為128、64、32、12、6、4、2、6 μg/L和0.1 μg/L。使用10 mmol/L PBS作為運行緩沖液，速率為20 μL/min。不同質量濃度OLA標準品和抗體以體積比1∶1混合，注射體積為60 μL，解離時間為300 s。通過響應值繪制OLA-OVA和OLA與OLA-Ab的結合曲線。每個OLA質量濃度重復3 次。

1.3.3 芯片的再生

芯片再現性是驗證所建立的方法是否實用的重要評估參數。本實驗比較4 種再生溶液：pH 2.2 Gly-HCl、pH 2.0 Gly-HCl、500 mmol/L NaCl和2.5 mmol/L NaOH。在每次結合實驗后，分別重復注射4 種再生溶液2 次。觀察并比較SPR響應的變化，選擇最佳再生液。

1.3.4 交叉反應

所有結構類似物用PBS稀釋至5 000、1 000、200、40、8 μg/L和1.6 μg/L。本實驗選擇的OLA結構類似物為喹烯酮、卡巴多、鹽酸克倫特羅、氯霉素和乙酰甲喹。用IC50計算交叉反應率，如下式所示：

1.3.5 樣品前處理

飼料從當地的超市購買，養殖水從天津的水產養殖場采集。在加標和回收實驗之前，通過HPLC驗證每個測試樣品不含有OLA。

水樣：（避光）取2 mL的水樣于4 mL的離心管中，加入OLA儲備液，使最終質量濃度為5、20 μg/L和40 μg/L。超聲波60 ℃加熱振蕩15 min，然后過0.22 μm濾膜待測，每個質量濃度3 個平行。

飼料樣品：（避光）稱取1 g飼料于10 mL的離心管中，加入OLA儲備液至5、20、40 μg/kg，加入2 mL水，60 ℃超聲波加熱15 min，以6 000 r/min離心10 min，取上清液。將上清液過0.22 μm濾膜后于4 ℃保存待測，每個質量濃度3 個平行。

1.3.6 樣品測定

樣品來自不同的超市與水產養殖場。樣品處理同1.3.5節，不需添加OLA標準品溶液，處理后于4 ℃保存待測，每個樣品重復測試3 次。

1.4 數據處理及圖表繪制

每組數據的平行組均為3 組，數據統計結果均為平均值，關于SPR的直接響應值結果，在SPR儀上使用專門的軟件Biacore進行圖表繪制，其他圖表用Origin進行繪制。

2 結果與分析

2.1 芯片預富集和抗原固定化

預富集實驗中，用pH 4.0乙酸鈉稀釋時，抗原固定的效果明顯高于其他pH值，抗原稀釋10 倍時，結合量與稀釋25 倍沒有明顯的增加，結果表明，OLA-OVA用pH 4.0乙酸鈉緩沖液稀釋，OLA-OVA的最佳稀釋倍數為25 倍。選擇原則是條件盡可能溫和且成本低。

用EDC/NHS激活芯片。用pH 4.0的乙酸鈉溶液將OLA-OVA稀釋25 倍，以與芯片表面上的羧基結合。當注射體積為60 μL時，結合趨勢基本保持不變。圖2顯示了綁定OLA-OVA到芯片表面的結果。

圖2 芯片表面抗原的結合Fig. 2 Binding of antigen on the chip surface

2.2 抗體結合質量濃度的確定

將不同質量濃度的OLA-Ab與已結合到芯片表面的OLA-OVA進行結合。通過分析相應的響應值圖，當抗體稀釋200～400 倍，結合趨勢減慢。為降低成本，確定OLA-Ab的最佳結合質量濃度為10.8 mg/L（抗體稀釋400 倍）。每個質量濃度重復3 次，每次結合后要進行芯片的再生，結合結果如圖3所示。

圖3 不同質量濃度的抗體與OLA-OVA結合Fig. 3 Binding of different concentrations of antibodies to OLA-OVA

2.3 再生液的確定

如圖4所示，經過實驗對比，不同pH值的Gly-HCl不能將抗體與抗原分離，基線不能回到起始值，再生效果不理想；NaCl基線可以，但每次再生效果不穩定；NaOH再生效果良好，基線基本平坦，結合水平基本穩定，因此確定2.5 mmol/L NaOH溶液是最合適的再生劑。

圖4 不同再生劑的結果Fig. 4 Regeneration efficiencies of different regenerants

2.4 OLA標準曲線建立

傳感器的檢測原理基于分析物與其抗原的間接競爭性免疫反應。將抗體與OLA混合，混合物注入傳感器芯片中。通過SPR檢測與OLA-OVA結合的抗體，從而將SPR獲得的響應與OLA質量濃度相關聯。在該實驗中，將OLA-Ab（10.8 mg/L）與等體積不同質量濃度的OLA混合，注入反應池。為OLA-OVA與0、0.6、2、4、6、12、32、64、128 μg/L OLA之間競爭抗體的結果見圖5。

圖5 OLA與OLA-OVA競爭結果Fig. 5 Results of competition between OLA and OLA-OVA

圖6顯示了抑制程度和OLA質量濃度之間的依賴性曲線，證明了OLA對OLA-Ab和OLA-OVA之間結合反應的抑制。抑制程度取決于與OLA-Ab混合的游離OLA質量濃度的線性變化。在最佳條件下，線性檢測范圍為0.5～64.0 μg/L OLA，檢出限為0.5 μg/L（RSN=3），檢測時間為10 min。

圖6 OLA的SPR檢測擬合性曲線Fig. 6 Standard curve for SPR detection of OLA

2.5 特異性確定

用SPR方法測定抗體與OLA及其結構類似物的交叉反應評估抗體的特異性。從表1可以看出，OLA抗體與OLA結構類似物（喹烯酮、卡巴多、鹽酸克倫特羅、氯霉素和乙酰甲喹）的交叉率均小于5%，表明該抗體可以特異性地識別OLA。

表1 SPR中OLA與OLA結構類似物的交叉反應Table 1 Cross-reactivity of OLA with analogues in SPR

2.6 樣品檢測結果

基質效應包括飼料中的維生素、蛋白質、脂肪和水產養殖水中的固體雜質和微生物。對于含有蛋白質和脂肪的魚飼料和雞飼料樣品，通過離心、稀釋和超濾可以簡單地減少基質干擾。對于含有固體雜質和微生物的魚養殖水和蝦養殖水樣，可以通過濾膜消除基質效應。

在養殖水和飼料樣品中加入5、20、40 μg/L OLA標準品。如表2所示，養殖水樣：回收率為84.7%～99.3%，變異系數（coefficients of variation，CV）為1.2%～8.3%。飼料樣品：回收率為89.3%～93.4%，CV為2.3%～10.1%。實驗測得魚飼料、雞飼料、魚養殖水、蝦養殖水中的測定靈敏度分別為8.9、8.7、5.5 μg/L和5.9 μg/L。證明該方法可以用于實際樣品檢測。

表2 SPR生物傳感器在3 個水平下的樣品回收率實驗（n= 3）Table 2 Recoveries for samples at three spiked concentration levels (n= 3)

為驗證該方法，同時用HPLC對樣品進行添加回收實驗，SPR與HPLC這2 種方法的檢測結果呈線性關系，線性方程式為y=0.983 5x+0.152 8，相關系數為0.997 2，表明兩種方法有較高的一致性。

建立的SPR方法用于檢測不同來源實際樣品水產養殖水和飼料中OLA的含量。多次檢測結果，在魚養殖水中，OLA質量濃度為5.0 μg/L，雞飼料中OLA質量濃度為6.1 μg/L；蝦養殖水與魚飼料中均未檢測到OLA，結果如表3所示。

表3 SPR方法檢測實際樣品的結果（n=3）Table 3 Results for detection of OLA in actual samples with SPR (n= 3)

2.7 芯片重復性

實驗對結合同源單、多克隆OLA抗體的芯片使用率進行了對比，表4表明，單克隆抗體的親和性高于多克隆抗體，檢測時間比較短，但結合同源多克隆OLA-Ab的芯片用2.5 mmol/L NaOH溶液再生60 次，活性衰減只有2.5%，而結合單克隆抗體的芯片同樣再生15 次，芯片的活性衰減已經為11.7%，檢出限與靈敏度也是多克隆抗體芯片比較好，因此，結合同源多克隆OLA-Ab，穩定性和芯片回收率較好，該實驗芯片具有良好的重復性，可重復使用。

表4 多克隆OLA-Ab與單克隆OLA-Ab的對比Table 4 Comparison of polyclonal OLA-Ab with monoclonal OLA-Ab

雖然單克隆抗體的親和力更強，但多克隆抗體可以識別多個表位，即使少量抗原表位被破壞或抗原的構象發生變化，實驗結果也不會受到影響，同時成本比較低，目前大多研究中均使用多克隆抗體進行實驗，在我們的工作中，使用多克隆OLA-Ab。

3 結 論

本實驗開發了一種固定在CM5芯片表面的OLA-OVA的SPR生物傳感器，用于檢測飼料和水樣中的OLA。該方法可以在樣品中檢測OLA時實現高效、快速、簡便。樣品檢測可在10 min內完成，包括結合180 s、解離300 s和再生60 次。OLA質量濃度在0.5～64 μg/L內有良好的線性，建立了SPR標準曲線。結合同源多克隆OLA-Ab，SPR芯片良好的穩定性，可以重復使用60 個循環，響應值衰減小于5%。研究SPR對雞飼料、魚飼料、魚養殖水和蝦養殖水中OLA定量的測定，回收率為84.7%～99.3%，CV為1.2%～10.1%（n=3），并且該SPR方法與HPLC方法具有良好的一致性。而該方法的靈敏度是Zhao Dan等[25]采用間接競爭性ELISA檢測OLA的3～4 倍，且成本低、時間短；是Zhao Dongyan等[26]采用新型的直接競爭仿生ELISA法測定雛雞飼料中的OLA的136～161 倍；也比Le Tao等[27]開發的ICG條帶檢測法更靈敏，是它的4 倍；比Peng Tao等[29]基于熒光微球的ICG法建立的用于同時檢測環境水和動物食品中OLA的方法，用的時間更短，檢測更加靈敏。該SPR方法可用于全面快速和選擇性檢測飼料和水樣品中OLA。