內異方對子宮內膜異位癥大鼠的治療作用以及對異位內膜VEGF、HIF-1α、NF-κB和PTEN表達的影響＊

李 瀟，劉陽陽，周艷艷，張白云，周俊英

（河南中醫藥大學第二附屬醫院婦產科 鄭州 450002）

當子宮內膜腺體和間質等組織出現在子宮內膜以外的子宮腔被覆內膜及宮體肌層以外的其他部位時，稱為子宮內膜異位癥（endometriosis，EM）[1]。流行病學調查[2-3]發現在育齡婦女中的發病率高達10%-15%，在伴有盆腔疼痛的育齡婦女中可達50%，且在EM 患者中約有30%-40%發生不孕現象。另外研究[4]發現，近年來EM 呈逐年升高的趨勢。再者，EM 具有轉移，浸潤，侵襲等惡性生物學行為，且容易發生惡變[5]。

一是多層次地推進城鎮化金融支持體系建設。首先全產業全體系的金融機制需要將現有的各類金融機構、城鎮基礎設施及相關配套進行合理納入。充分發揮國家層面的政策導向作用，通過引導政策性銀行等金融機構創設種類更加豐富的金融業務，尤其是低息業務貸款。試點工作可以提供新的發展模式，在城鎮化率較高的區域率先推廣試點金融創建模式。對金融機構而言，需重視環境帶來的投融資變化。其次需重視民間資本的合理引入。市場化改革表現為資本的多樣化并存，民間資本的代入有利于金融市場的健康發展。但也需要通過專業的民間資本借貸機構對其行為進行合法化監管。

設P點可以接收到m個信標節點的信號,將m個信標節點以3個不共線的為一組分組,假設一共有k組。通過第1部分的數學模型可以計算出k個P點的坐標值,分別是(xP1,yP1),…,(xPk,yPk)。這k個坐標值即LOGGWO算法的部分初始值,通過算法尋優得到未知節點P的優化坐標。設改進灰狼優化算法的種群大小為N。若k≥N,則選用根據適應度值從小到大選取前N個作為初始值;若k

針對田間雜草，除雜草種類及農藥安全施用外，同時應結合種植區域地理條件及種群選擇施藥。如來自不同地理種群條件下，節節麥呈現出不同甲基二磺隆耐藥性，野芥菜對同濃度草甘膦呈現敏感型和耐受型2種不同表型[36-37]，田間雜草并不茂盛時，可選擇人工摘除。

目前，臨床上一般采取傳統的化學藥物與手術聯合治療[6]EM，但傳統的化學藥物副作用大，且療效不顯著，手術治療后極易復發[7]。因此，尋找有效的藥物對提高EM 患者的身心健康具有重要的意義。中醫認為EM 的主要病機是痰瘀互結，常采用祛瘀散結，理氣化痰的治療方案[8]。內異方中炙鱉甲軟堅散結，干漆，血竭，赤芍與香附活血祛瘀，行氣止痛，牛膝，桂枝溫通經脈，逐瘀，諸藥合用，起到祛瘀活血，調節氣機，使得氣血津液正常運行。已有多篇文獻[9-11]表明內異方在臨床上對EM 具有療效，但并未對其作用機制進行研究。本實驗通過子宮內膜自體移植法建立EM 大鼠模型，觀察內異方對EM 大鼠的異位內膜病理學結構改變、促炎因子IL-6和IL-8的分泌以及異位內膜組織VEGF、HIF-1α 和NF-κB 蛋白表達的影響。本研究不但從一個全新的角度（炎性和缺氧微環境的角度）闡明了內異方對EM 大鼠的改善作用，還為EM 進一步加快運用于臨床治療EM提供了一定的實驗基礎。

里帕的借鑒方式簡單直接：如擬人形象“友誼”（方案D），他說“一個瞎子背著一個瘸子行路”的形象來表現“友誼”主題，是出自阿爾恰托的描述：“他在一個瞎子的背上，用聲音領路。所以兩人組合在一起意味著，一個提供視力一個提供腳力”。?

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

成年未孕SD 大鼠共45 只，雌性，清潔級，9-10 周齡，體重190-210 g，購自河南省實驗動物中心[SCXK（豫）2017-0001]，飼養于河南省中醫院中心實驗室動物房[SYXK（豫）2016-0009]中，溫度維持在20-25 ℃，相對濕度為50%-65%，光照黑暗各12 h，自由攝取食物與水，進行適應性飼養2 周。動物實驗獲得河南省中醫院實驗動物倫理委員會的批準（倫理審查證號：2017-28），本實驗完全遵循國家實驗動物福利倫理的相關規定，符合動物保護、動物福利和倫理原則。

1.1.2 實驗藥物

內異方（組方構成：當歸9 g、丹參12 g、赤芍9 g、制香附9 g、血竭3 g、川牛膝9 g、桂枝3 g、炙鱉甲9 g、皂角刺12 g、干漆4.5 g、茯苓12 g、海藻9 g）購于河南省中醫院中藥房，制成每毫升相當于原生藥2 g 的水煎劑，并濃縮水煎劑至每2 mL相當于成人用量。達那唑膠囊（批號：20160814）購自江蘇聯環藥業股份有限公司，除掉膠囊殼后，將粉末與生理鹽水制成混懸液。

1.1.3 主要試劑與儀器

核轉錄因子-Kappa B（nuclear factor-Kappa B,NF-κB）單克隆抗體、第10 號染色體缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）多克隆抗體、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標記免疫球蛋白（immunoglobulin G，IgG）（H + L）抗體購自美國Cell Signaling techonology 公司；低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）單克隆抗體、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體購自美國Abcam 公司；IL-6和IL-8 ELISA 試劑盒購自購自南京森貝伽生物科技有 限 公 司 ；放 射 免 疫 沉 淀 法（Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解液購自北京普利萊公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天公司。CUT4062 型手動切片機購自德國SLEE 公司；EG1150H 型包埋機購自德國Leica 公司；BX51 型正置熒光顯微鏡、DPBSW 型全自動圖像分析系統購自日本Olympus 公司；ELX800型酶標儀購自美國Bio-TEK公司。

1.2 實驗方法

本實驗采用子宮內膜自體移植法建立EM 大鼠模型，入組共45 只大鼠，其中2 只在造模過程中死亡，3只大鼠造模失敗。假手術組納入10 只大鼠，其余30只大鼠可明顯觀察到移植物與透明囊腫，表示造模成功，總造模成功率88.89%。

最后，中國近現代史基本問題研究還應該對中國近現代史研究中的成果進行借鑒，這兩者在學科的研究上屬于相通的，所以應該對這兩個學科之間的關系進行協調處理，通過統籌規劃，來對二者進行整體上的規劃，以中共黨史學科為主要的基礎，來對這兩個學科進行組建，并以中共黨史研究隊伍為基本力量，[1]48為兩門學科的發展提供保障。

1.2.2 實驗分組

大鼠按照1.2.1 方法進行EM 造模。同時選取10只大鼠不進行切除子宮段和自體子宮內膜移植，其他手術方式同EM 造模手術；此大鼠作為假手術組。在EM 造模3 周后，腹腔注射10%水合氯醛（2.5 mL·kg-1）麻醉大鼠，采用仰臥位方式固定并開腹觀察移植物的生長情況。造模成功判定標準：移植物體積增大，出現液體積聚，積液深度≥2 mm，移植物鏡檢有子宮內膜上皮、間質細胞與腺體。取EM 造模成功的大鼠，逐層關腹，術后分籠常規喂養，術后腹腔注射硫酸慶大霉素，0.1 mL/天，共3 天。然后，隨機將EM 造模成功的大鼠分為3個亞組，即模型組、內異方治療組和陽性對照組，每組10 只大鼠。最后，假手術組和模型組大鼠給予生理鹽水2 mL/天灌胃，內異方治療組給予內異方水煎劑濃縮液2 mL/天灌胃，陽性對照組給予達那唑0.072 mg/kg/天（達那唑混懸液2 mL/天）灌胃，各組連續給藥4周。

采用ELISA 試劑盒分別檢測子宮內膜異位組織或假手術組同位置的內膜組織中IL-6 和IL-8 水平。收集子宮內膜異位組織或假手術組同位置的內膜組織樣品，按照試劑盒說明書步驟對樣品蛋白進行萃取、定量后，將每樣品按100μl/孔加入已包被IL-6 和IL-8 抗體96 孔的酶標板中，室溫孵育60 min；之后分別加入100μl/孔生物素標記的二抗稀釋液，室溫孵育60 min；洗板后，加入100μL/孔親和素-過氧化物復合物稀釋液，室溫孵育45 min；洗板后，加入100μL/孔顯色液，37℃避光反應15 min；最后加入100 μL/孔終止液。在酶標儀450 nm波長下測定OD值。然后根據預制的濃度曲線計算組織中IL-6和IL-8的水平。

1.2.4 ELISA檢測炎性因子分泌

采用Western blot法檢測模型組、內異方治療組和陽性對照組的異位內膜組織或假手術組同位置的內膜組織中VEGF 和HIF-1α的蛋白表達水平，結果如圖2 所示：與假手術組相比，模型組大鼠異位內膜組織中VEGF 和HIF-1α 蛋白表達水平均顯著增高，差異均有統計學意義（均P<0.05）；與模型組相比，內異方治療組與陽性對照組大鼠異位內膜組織中VEGF 和HIF-1α 蛋白表達水平明顯降低，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；與陽性對照組相比，內異方治療組大鼠異位內膜組織中VEGF 和HIF-1α蛋白表達均稍低，但差異不具有統計學意義（均P > 0.05）。以上結果說明，內異方能抑制EM 大鼠的異位內膜組織中VEGF 和HIF-1α的蛋白表達。

1.2.3 HE染色

當然，我提這個建議主要是讓自己脫穎而出，寫詩雖然不會，背詩總會吧。納蘭性德、倉央嘉措，“一生一世一雙人”、“你來或者不來，愛就在那里，不離不棄”哇哈哈，隨便拿幾首出來就能鎮住她們。我在心里樂顛顛地打著如意小算盤。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達

稱取50 mg異位內膜組織或假手術組同位置內膜組織，并在冰上剪碎，加入預冷RIPA 裂解液，冰浴上勻漿。在4℃條件下，10000 r·min-1離心20 min，收集總蛋白上清液。總蛋白經BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量后，調整蛋白終濃度為4.0 mg·mL-1，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。恒壓電泳80 min后，蛋白經電轉移至PVDF膜。將PVDF膜完全浸入封閉液，輕搖60 min 后，在4℃條件下孵育一抗[（稀釋比例為1∶1000）VEGF、HIF-1α、PTEN、NF-κB 和β-actin 抗體]過夜。TBST 洗膜3 次后，孵育二抗[（稀釋比例為1∶1000）HRP 標記IgG（H + L)抗體]，室溫孵育30 min，TSBT 洗膜3 次，將ECL 超敏發光液傾入膜上，曝光，顯影，自來水沖洗晾干。掃描膠片，并用Image J 1.41 軟件計算條帶灰度值。目標蛋白的相對表達量=目標蛋白灰度值/內參β-actin灰度值。

2 統計學分析

使用SPSS17.0 對實驗數據進行統計學分析，所有計量資料均采用平均值±標準差（±s）表示，多組間計量資料倆倆比較采用單因素方差分析的post-hoc test Bonferroni-t檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。

3 結果

3.1 EM造模情況

1.2.1 EM大鼠模型建立

實驗過程依據實驗動物使用的3R 原則對實驗動物給予人道主義關懷。根據文獻[12]描述的方法：選擇已經經過連續2 個正常動情周期的大鼠，在第3 個動情期開始時，依據子宮內膜自體移植法建立EM 大鼠模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（2.5 mL·kg-1）麻醉后，采用仰臥位方式固定，于尿道口上約1 cm 處垂直正中縱切開，分離左側子宮，近端離子宮角1 cm 處結扎，遠端離卵巢2 cm 處結扎，并結扎中間的子宮系膜血管，切除約1.5 cm 的子宮段，放入滅菌生理鹽水玻璃皿中，縱切開子宮腔，分離子宮內膜組織，修剪為5 mm×5 mm的小塊，并將修剪的內膜組織用可吸收線固定四角縫合種植于腹壁血管豐富處，腹腔內放置慶大霉素0.4 mL，逐層關腹，術后分籠常規喂養，術后腹腔注射硫酸慶大霉素，0.1 mL/天，共3天。

3.2 各組大鼠內膜組織病理形態

HE 染色結果如圖1顯示，假手術組大鼠子宮內膜上皮結構完整呈柱狀、大小均一且排列緊密，微絨毛密集，間質細胞排列整齊，同時腺體豐富，細胞核形狀呈現類橢圓形；模型組異位內膜上皮可見立方體增生且排列稀疏，間質細胞增多、增厚，微絨毛脫落，腺體也幾乎消失，內膜極薄；內異方治療組子宮內膜上皮細胞排列緊密，細胞大小均一，但部分微絨毛脫落，腺體較豐富；陽性對照組異位內膜細胞大小均一呈柱狀，且排列緊密，腺體較豐富。以上結果說明，內異方能改善EM大鼠的異位內膜病理學結構改變。

今年“龍抬頭”，中華龍舟大賽來到海南萬寧，在和樂鎮港北港拉開全年比賽的大幕。萬寧與龍舟的相遇并非偶然，萬寧地處大海之南，自古以來，這里便延續了與中原大陸一脈相承的龍文化，除了每年的賽龍舟外，這里普遍會把食品名稱加上“龍”字，比如水餃稱作“龍耳”，烙餅稱作“龍鱗”，米飯稱作“龍子”以求吉祥福瑞，萬家平安。

3.3 各組大鼠內膜組織IL-6和IL-8的水平

采用ELISA 法檢測模型組、內異方治療組和陽性對照組的異位內膜組織或假手術組同位置的內膜組織中IL-6 和IL-8 的水平，結果如表1 所示：與假手術組相比，模型組大鼠異位內膜組織中IL-6和IL-8水平均顯著增高，差異均有統計學意義（均P<0.05）；與模型組相比，內異方治療組與陽性對照組大鼠異位內膜組織中IL-6和IL-8水平明顯降低，差異均有統計學意義（均P<0.05）；與陽性對照組相比，內異方治療組大鼠異位內膜組織中IL-6和IL-8水平均稍高，但差異不具有統計學意義（均P>0.05）。

圖1 HE染色檢測模型組、內異方治療組和陽性對照組的異位內膜組織或假手術組同位置的內膜組織病理形態（×200）

表1 各組大鼠異位內膜組織IL-8和IL-6的水平比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠異位內膜組織IL-8和IL-6的水平比較（n=10，±s）

注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

Group假手術組模型組內異方治療組陽性對照組F值IL-8/(pg/g)129.45±19.39 354.22±41.04*172.57±23.45*#159.45±25.43#75.312 IL-6/(pg/g)216.06 ±28.44 421.37±36.52*286.38±35.43*#262.54±29.42#178.368

3.4 VEGF與HIF-1α的蛋白表達水平

末次給藥24 h 后，腹腔注射10%水合氯醛（2.5 mL·kg-1）麻醉大鼠，采用仰臥位方式固定并開腹大鼠分離異位內膜組織或假手術組同位置內膜組織。組織分為兩部分，一部分直接凍存在-80℃冰箱，用于后續ELISA 和Western blot 檢測；另一部分組織以4%多聚甲醛固定12 h，固定后生理鹽水沖洗固定液，然后采用常規梯度酒精脫水，二甲苯透明和石蠟包埋。取石蠟包埋的異位內膜組織或假手術組同位置內膜組織，利用CUT4062 型手動切片機切成5μm 厚度的組織切片。石蠟切片脫臘后，蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化15 s，蒸餾水沖洗2 min，1%Na2HPO4?12H2O 溶液返藍5 s，蒸餾水沖洗1 min，伊紅染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，依次運用不用濃度的50%-70%-80%-95%-無水乙醇梯度脫水，每次5 min，二甲苯透明3 min；中性樹膠封片后BX51 型顯微鏡下進行觀察內膜組織病理學改變并隨機選擇10 個視野進行拍照。

圖2 Western blot檢測模型組、內異方治療組和陽性對照組的異位內膜組織或假手術組同位置的內膜組織中VEGF與HIF-1α的蛋白表達水平

3.5 PTEN和NF-κB蛋白表達水平

圖3 各Western blot檢測模型組、內異方治療組和陽性對照組的異位內膜組織或假手術組同位置的內膜組織中PTEN和NF-κB的蛋白表達水平

給藥4 周后，采用Western blot 法檢測模型組、內異方治療組和陽性對照組的異位內膜組織或假手術組同位置的內膜組織中PTEN 與NF-κB的蛋白表達水平，結果如圖3 所示：與假手術組相比，模型組大鼠異位內膜組織中PTEN 蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（均P < 0.05），NF-κB 的蛋白表達水平顯著增高，差異均有統計學意義（均P<0.05）；與模型組相比，內異方治療組和陽性對照組大鼠異位內膜的PTEN 蛋白表達水平均明顯增高，差異均有統計學意義（均P<0.05），NF-κB 的蛋白表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；與陽性對照組相比，內異方治療組大鼠異位內膜組織中PTEN 蛋白表達均稍高，但差異不具有統計學意義（均P>0.05），而NF-κB 的蛋白表達水平明顯增高，差異均有統計學意義（P<0.05）。以上結果說明，內異方能抑制EM 大鼠的異位內膜組織中PTEN和NF-κB的蛋白表達。

4 討論

目前，西醫認為EM 是一種雌激素依賴性疾病[13]。于是，對EM 的治療，其主要手段是維持一種低雌激素的狀態，但是這種療法也同時引發了一系列的副作用，其中以骨密度的降低最為顯著[14]。中醫藥理論認為，EM 辯證病位當屬下焦，是由于氣郁血淤導致的經血逆流所致[15]，因此，可采用化疲益氣、活血化瘀之內異方對EM 給予治療。本研究發現，內異方能改善大鼠EM。

異位內膜組織種植于腹腔并得以生長依賴于豐富的營養物質供應[16]，而營養物質的供應需要大量微血管的生成[17]，因此，微血管生成是EM 發生的關鍵步驟。而VEGF是至今以來發現的特異性最高的促血管生成因子[18]。VEGF 具有促進血管內皮細胞通透性增強，加速血管內皮細胞增殖、遷移、粘附的作用，并能最終誘導微血管生成[18-19]。且已有文獻[20]報道，在EM患者的腹水和異位內膜組織中VEGF 的表達明顯增加。提示，VEGF高表達是EM 患者異位內膜賴以生長的重要因素。本研究同樣發現在EM 大鼠的異位內膜組織中VEGF 表達增加；而內異方給藥后，能夠抑制EM大鼠的異位內膜組織中VEGF的表達。

EM 的發病與發展與腹腔內微環境的變化密不可分。EM 患者常常伴隨有腹腔缺氧狀態，而EM 的造成腹腔缺氧微環境的形成正是EM 發生與發展的重要因素[21]。在缺氧微環境形成后，缺氧誘導因子HIF-1α的表達增強，而缺氧誘導因子HIF-1α 表達被認為與EM的散播與種植密切相關[22]。另外有研究表明[23]，缺氧也是促進內皮細胞分泌VEGF 的重要因素，人子宮內膜細胞在缺氧環境下培養12 h 后，VEGF 表達顯著增加。而VEGF表達增加正是異位內膜中微血管生成的重要條件。本研究同樣發現EM 大鼠的異位內膜組織中HIF-1α 表達增加；而內異方給藥后，能夠抑制異位內膜組織中HIF-1α 的表達，從而改善了大鼠子宮內膜的腹腔內部缺氧微環境，致使下調VEGF的表達，改善異位內膜的增長。

NF-κB 是一種重要的細胞核轉錄因子，發揮著多種生物學功能。EM 患者常常伴隨有促炎因子的異常升高的腹腔炎性微環境[24]。Tao X 等[25]研究結果表明，EM病灶中NF-κB的表達成強陽性。而NF-κB被激活后，可使得許多促炎細胞因子、趨化因子以及促血管生成相關因子被上調表達，而這些細胞因子異常上調進一步促進異位內膜的種植和生長，從而促進EM 的發生和發展[26]。本研究發現，在EM 大鼠的異位內膜組織中IL-6 和IL-8 水平顯著增高和NF-κB 的表達明顯增加，而內異方抑制EM 大鼠的異位內膜組織中IL-6和IL-8水平以及NF-κB的表達。

在多種子宮內膜病變中PTEN 因子表達變化具有特殊的意義[27-28]。有文獻[27]指出在子宮內膜增生中PTEN 蛋白的缺失可能會導致子宮內膜生長失控。Zheng 等[28]研究發現PTEN 的無表達或低表達的內膜細胞轉移能力與侵襲能力均有所增加，易出現內膜細胞轉移至子宮腔以外的地方，從而誘發EM。PTEN 表達下調可通過激活PI3K/Akt 信號通路并促進NF-κB表達上調，再者子宮異位內膜碎片在缺氧環境下進一步刺激NF-κB 的表達增加，負反饋調節使得PTEN 表達下調，使得EM 加重[29]。本研究同樣發現EM 大鼠的異位內膜組織中PTEN 表達降低；而內異方促進EM 大鼠的異位內膜組織中PTEN的表達。

Notes: Confucius is said to have read The Book of Changes ( Yi Jing) so many times that the leather strings binding the bamboo slips upon which the book was written broke three times．[2]46

綜上所述，內異方能夠緩解對缺氧環境中的異位內膜組織的增厚，改善缺氧情況，從而對EM 大鼠具有明顯的改善作用。推測這種改善作用可能是由于內異方能夠抑制異位內膜組織中HIF-1α和NF-κB表達，從而減緩腹腔的炎性和缺氧微環境，進而降低異位內膜組織中VEGF的表達同時促進PTEN的表達，致使異位內膜組織中微血管生成減少，導致異位內膜組織內膜種植得以生長的營養物質供應不足，最終改善EM。本實驗對內異方臨床上治療EM提供的實驗依據。