基于Ang/Tie-2信號通路研究補腎活血方導法調控大鼠種植窗期子宮組織血管生成的助孕機制＊

嚴 莉，郭 珮，周 航，夏宛廷，黃金珠，曾鵬飛，曾 倩

（成都中醫藥大學附屬醫院 成都 610072）

不孕癥是婦科常見疑難雜病，中醫學認為腎藏精、主生殖，“胞絡者系于腎”“男精壯”“女經調”“氤氳時”“陰陽和”是孕育的基礎。在總結前人經驗后，《石室秘錄·子嗣論》提出“女子不能生子有十病”，其中“胞宮寒”是首病。現代中醫臨床研究表明，“腎虛血瘀”是目前女性不孕的主要癥型[1]。現代生殖醫學認為，種植窗期是子宮內膜允許胚胎著床的關鍵時期，胚胎植入過程伴隨子宮組織生成豐富的血管[2]，為胚胎附著和著床提供了必要的物質，是確保胚胎種植成功的關鍵[3-5]。而血管生成是通過體內存在諸多互補和復雜的信號途徑調節，其中血管內皮生長因子（VEGF）-血管內皮生長因子受體（VEGFR）、血管生成素（Ang）-Tie2 軸和Notch 信號通路在調節血管生成中發揮重要作用。已有研究表明，血管生成調控因子Ang-1、Ang-2、Tie-2、VEGF 在種植窗期子宮組織及早期胎盤中出現高表達[6-7]。亦有研究發現子宮內膜局部炎性反應有助于改善妊娠結局[8]，這可能與炎癥調節血管生成有關[9]。因此，研究中藥對種植窗期子宮組織血管生成的影響對闡釋中藥的助孕機制具有重要意義。

本課題組結合導法（直腸灌注）給藥能更接近“胞宮”，并能溫通血脈和直接物理暖宮的特點，運用補腎活血方導法治療腎虛血瘀型女性不孕癥患者，能提高臨床自然妊娠率[10]。前期研究已表明，補腎活血方導法治療可提高腎虛血瘀型大鼠種植窗期子宮內膜組織的血液灌注[11]。本研究采用大鼠腎虛血瘀-胚胎著床障礙病證結合模型，從種植窗期子宮內膜形態學特征、螺旋動脈數量和血管生成相關因子的表達情況等方面，研究補腎活血方導法給藥治療不孕癥，調控種植窗期子宮組織血管生成的助孕機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級健康成年雌性未孕SD 大鼠70 只，體重220±20 g，從中篩選動情周期規律的雌性大鼠60 只，SPF 級健康成年雄性SD 大鼠20 只，體重250±20 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供（合格證號：SCXK（川）2015-030），于成都中醫藥大學中醫臟腑病證實驗室動物房飼養。

1.2 實驗藥物

補腎活血方（原助孕Ⅰ號方）由大菟絲子、枸杞子、覆盆子、續斷、絲瓜絡、山楂、丹參和山藥八味藥組成。此方由四川省第三批名中醫提供，專利名稱：一種治療或輔助治療不孕癥的藥物組合物及其制備方法和用途，專利號：ZL201410390113.7；由四川省中醫院中藥制劑室提供，規格：50 mL/瓶，生產日期：20180811，成人日用量：0.73 g生藥/kg。阿司匹林腸溶片：拜阿司匹林公司，規格：100 mg/片，生產批號：BJ38807，國準字號：J20171021，成人日用量：1.07 mg/Kg。羥基脲片：齊魯制藥有限公司，規格：500 mg/片，生產批號：8CO133D05，國準字號：H37021289。鹽酸腎上腺素注射液：天津金藥藥業有限公司，規格：1 mL/支，生產批號：1710201，國準字號：H12020526。米非司酮片，華潤紫竹藥業有限公司，規格：25 mg/片，生產批號：431706061，國準字號：H10950003。

1.3 主要試劑

VEGF 兔抗鼠一抗（博士德生物公司，BA0407）、山羊抗小鼠熒光二抗（美國Abbkine 公司，A23227，A23210）、VEGF、FLK-1 ELISA 試劑盒（SHANGHAI WESTANG BIO-TECH CO.,LTD，批號分別為F17120、F17121）、PCR 引物（tsingke 公司）、Anti-Ang1 抗體（abcam 公司，ab102015）、Anti-Ang2抗體（abcam 公司，ab155106）、羊兔抗HRP（Jackson ImmunoResearch 公司 ，111-035-003）、Anti-TIE2（abcam 公 司 ，ab227219）、Trizol 試 劑（Invitrogen 公 司，182808）、SYBRGreenPCR試劑盒（Roche公司，1803058）。

2 方法

2.1 藥物制備

阿司匹林用蒸餾水配制成濃度為1.35 mg/mL 的藥液，6.75 mg/Kg·d。羥基脲用蒸餾水配制成濃度為96 mg/mL 的藥液，450 mg/Kg·d。米非司酮用蒸餾水配制成濃度為2.2 mg/mL的藥液，5.5 mg/Kg·只。

2.2 腎虛血瘀-胚胎著床障礙病證結合模型建立

參照齊寧等[12]建立的大鼠胚泡著床障礙動物模型、馮倩怡等[13]建立的腎虛血瘀-子宮內膜容受性不良模型及田瀅舟等[14]建立的腎虛胚胎著床障礙小鼠病證結合模型，建立腎虛血瘀-胚胎著床障礙病證結合模型。除空白組，其余每組均予羥基脲450 mg/(kg·d)灌胃，每日一次，連續10 天，于第4 天開始加用腎上腺素0.3 mg/(kg·d)皮下注射7天造成腎虛血瘀模型；空白組予等量生理鹽水灌胃10 天，第4 天開始加用等量生理鹽水皮下注射7 天。于第11 天起，陰道涂片篩查各組動情期大鼠，每晚18:00按雌雄2∶1合籠，第二天早上7:00 觀察陰栓或行陰道涂片觀察精子，發現陰栓或精蟲者為妊娠第1 天；除空白組其余各組均于妊娠第4天頭頸部皮下注射米非司酮溶劑，5.5 mg/kg，造成著床障礙性不孕癥模型，空白組則予等量芝麻油溶劑注射。

2.3 分組與給藥

連續2 個動情周期陰道涂片觀察，篩選動情周期規律的大鼠60 只，動情前期時入組，按隨機數字表法分為空白組、模型組、對照組及補腎活血方高、低劑量組（分別簡稱“高劑量組”“低劑量組”），每組各12 只，于造模第1 天開始，每日10:00，低劑量組、高劑量組分別予補腎活血方濃縮液4.6 g/kg、9.2 g/kg灌腸，連續10天；空白組、模型組分別予生理鹽水5 mL/kg 灌腸，連續10 天；對照組則于每日10:00 予阿司匹林腸溶片6.75 mg/Kg·d灌胃，連續10天。

2.4 處理及標本采集

于妊娠第5 天早上8：00，每組隨機取6 只，予1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉后固定，剖腹行腹主動脈采血5 mL，采血后快速取出雙側子宮，分離周圍脂肪組織，電子分析天平稱量并記錄各組大鼠子宮、卵巢濕重，計算各組大鼠子宮臟器指數。取同側同部位1/4子宮放入EP管，4%多聚甲醛固定，4℃保存，用于光鏡下觀察；取同側同部位1/4 子宮放入EP 管，4%多聚甲醛固定，用于切片觀察和免疫組化法檢測；取同側同部位1/4 子宮放入RNA later 保存液中，-80℃保存，用于Real-Time PCR 檢測；取同側同部位1/4子宮直接放入凍存管，-80℃保存，用于Western-Blot 檢測。所有器械都經DEPC水清洗后再使用。

2.5 采用酶聯免疫法（ELISA）檢測大鼠血漿VEGF、FLK-1表達水平

制備標準溶液：取8個1.5 mL離心管，第一管加標本稀釋液900μL，第二至第八管加入標本稀釋液500μL。在第一管中加入10μg/mL 的標準品溶液100μL置于漩渦混合器上混勻后用加樣器吸出500μL，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500μL 棄去。第八管為空白對照。用1∶20 雙蒸水稀釋，100μL 待測血漿加入每孔，混勻，37℃40 min，洗滌4-6 次，濾紙上干燥，除空白每孔添加50μL 雙蒸水和一抗，混勻，37℃20 min，洗板，添加100 μL 酶標抗體，37℃10 min，洗板，加入100 μL 底物工作液，暗光中37℃15 min，添加100μL 停止溶液混勻，并在30 分鐘內用微板讀數儀測量450 nm 處的吸光度。以標準品1000 ng/mL、500 ng/mL、250 ng/mL、125 ng/mL、62.5 ng/mL、31.2 ng/mL、15.6 ng/mL、0 ng/mL 為橫坐標，OD 值為縱坐標，使用軟件作圖，畫出標準曲線。根據樣品OD值計算出相應VEGF、FLK-1含量。

2.6 采用免疫組化法（IHC）檢測大鼠子宮內膜VEGF表達水平及螺旋動脈數量

將1/4 大鼠子宮置于4%多聚甲醛固定48 小時后取出，逐級酒精脫水，經二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋后切片，將白片在60℃烤箱內烤4-6 h，37℃孵箱過夜，二甲苯脫蠟2 次，每次10 min，酒精梯度復水，每次3 min，去離子水震蕩洗滌2 次，每次5 min，抗原修復，室溫冷卻，3%H2O2 室溫避光浸泡10 min，PBS 洗滌3次，每次5 min；滴加封閉血清，室溫孵育15 min，滴加一抗，4℃過夜；復溫15 min，PBS 洗滌3次，每次5 min；滴加二抗，常溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加二抗，常溫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min，DAB顯色，蘇木素復染，酒精梯度脫水，二甲苯2次，每次10 min，中性樹膠封片，檢測VEGF的表達水平。

表1 Ang-1、Ang-2、Tie-2基因引物序列

2.7 Real-Time PCR 檢 測 大 鼠 子 宮Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA表達水平

組織冰上解凍后，倒出保存液，在EP 管中加入1 mL Trizol 提取子宮組織中DNA，并進行核酸品質確認，反轉錄，加入90 μL RNAfree 水稀釋，加入相應引物，用GAPDH 作內參，退火溫度54℃。擴增條件：94℃變性3 min，30 個循環；72℃延伸10 min。SYBR green 法檢測Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA 表達水平。引物序列參見表1。

2.8 Western-Blot 檢測大鼠子宮Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白相對表達水平

子宮組織勻漿后加入適量RIPA 裂解液，制備蛋白并測定蛋白含量，配膠，電泳，轉膜，加入一抗、二抗，用ECL 法顯色，覆蓋在PVDF 膜反應1min，保鮮膜包裹，去殘液，放入X 光片夾曝光、顯影定影。掃描圖像，使用Image-J 圖像分析軟件條帶積分值，檢測大鼠子宮Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白表達水平。

2.9 統計學方法

所有數據均采用SPSS 25.0統計分析軟件處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One.Way ANOVA）。方差齊，采用單因素方差分析中的LSD（Least-significant diffrerence）方法進行多重比較檢驗；方差不齊，采用Tamhane' S T2進行多重較檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 各組大鼠種植窗期子宮內膜形態學變化（HE×200）

3 結果

3.1 腎虛血瘀-胚胎著床障礙病證結合模型大鼠子宮內膜形態學變化

模型組大鼠子宮內膜發育較差，螺旋動脈少，位于基層，內膜腺體小而直，細胞呈梭形，部分間質致密，呈增生期改變；部分間質疏松、水腫，呈分泌期改變，間質發育不同步（見圖1-A）。空白組、阿司匹林組與給藥組大鼠子宮內膜發育較好，螺旋小動脈增生，接近功能層，腺體數量多，分布均勻，腺體彎曲，腺上皮多呈單層高柱狀上皮細胞，并夾雜有透亮細胞，少數出現頂漿分泌，腺腔明顯增大，內有分泌物，間質疏松水腫，部分間質中見梭形細胞（見圖1-B，圖1-C，圖1-D，圖1-E，圖1-F）。表明補腎活血方能改善模型大鼠子宮內膜組織形態，使內膜增厚且松軟，利于胚胎著床。

3.2 補腎活血方導法對模型大鼠種植窗期子宮組織VEGF、FLK-1的表達影響

各組大鼠子宮內膜經IHC 染色后，200 倍光鏡下觀察VEGF 的表達情況，陽性染色為胞漿內棕黃色顆粒狀或細絲狀。由圖2可見，VEGF在各組大鼠子宮內膜上皮及間質均有表達，模型組大鼠VEGF 表達呈黃色、淺黃色，分布稀疏，面積較小（見圖2-A）；空白組大鼠VEGF表達呈棕黃色、黃色，分布密集，面積較廣（見圖2-B）；給藥組及阿司匹林組較模型組VEGF 表達均有不同程度增加，呈棕黃色、黃色，分布較密集，面積較廣（見圖2-C，圖2-D，圖2-E）。表明補腎活血方能促進模型大鼠子宮內膜VEGF表達。

由表2 可見，模型組大鼠子宮內膜VEGF、FLK-1表達量較空白組明顯降低（P < 0.05），螺旋動脈數量也顯著降低（P < 0.01）；給藥高劑量組大鼠VEGF、FLK-1 表達量和螺旋動脈數量均顯著高于模型組（P < 0.01）；給藥低劑量組大鼠螺旋動脈數量較模型組顯著升高（P<0.01），VEGF、FLK-1表達量也高于模型組。結果表明，補腎活血方高劑量給藥能提高模型大鼠血漿中VEGF、FLK-1 表達水平及促進子宮內膜螺旋動脈增生，而低劑量組血漿中VEGF、FLK-1 表達量升高未見統計學差異，推測可能與其血藥濃度有關。

3.3 補腎活血導法對各組大鼠子宮濕重及臟器指數的影響

由表3 可知，模型組大鼠子宮濕重和子宮臟器指數均較空白組低（P<0.05）；給藥高劑量組、低劑量組和阿司匹林組大鼠子宮濕重及子宮臟器指數均高于模型組（P < 0.05），且給藥高劑量組與空白組之間無統計學差異（P > 0.05）。研究結果表明，補腎活血方導法給藥可增加模型大鼠子宮濕重及子宮臟器指數，具有修復子宮受損的作用。

圖2 各組大鼠種植窗期子宮內膜VEGF表達變化（VEGF染色×200）

表2 補腎活血導法對各組別VEGF表達及螺旋動脈數量變化（±s）

表2 補腎活血導法對各組別VEGF表達及螺旋動脈數量變化（±s）

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

螺旋動脈數量74.33±20.12**139±25.42##模型組空白組等量生理鹽水等量生理鹽水6 6 369.9±38.77*503.55±100.94#448.64±143.70*635.99±116.07#128.33±25.37##163.83±20.90##135.33±12.72##組別低劑量組高劑量組阿司匹林組劑量7.3 g/Kg 14.6 g/Kg 6.75 mg/Kg n 6 6 6 VEGF（pg/ml）487.37±131.70 583.43±140.12##586.46±58.11##FLK-1（pg/ml）484.34±167.52 691.71±146.24##639.67±119.67#

表3 各組大鼠子宮濕重及臟器指數

3.4 補腎活血導法對各組大鼠子宮組織Ang-1、Ang-2、Tie-2的蛋白表達影響

由圖3、表4可見，模型組與空白組比較，大鼠Tie-2 表達顯著降低（P < 0.01）；給藥低劑量組Tie-2 表達較模型組高（P < 0.05）；給藥高劑量組和阿司匹林組大鼠Ang-1、Tie-2 表達量較模型組均顯著升高（P <0.01）；Ang-2 表達在各實驗組間沒有統計學差異，但給藥組有增高的趨勢。研究結果表明，補腎活血方主要影響大鼠子宮Ang-1、Tie-2 蛋白表達，并能提高模型大鼠子宮組織Ang-1、Tie-2蛋白表達水平。

表4 各組干預后Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白相對表達水平（±s）

表4 各組干預后Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白相對表達水平（±s）

注：與空白組比較：*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組比較：#表示P<0.05，##表示P<0.01

組別模型組空白組低劑量組高劑量組阿司匹林組n 6 6 6 6 6蛋白相對表達水平Ang-1 0.36±0.13 1.08±0.42 0.63±0.46 0.98±0.23##0.79±0.05##Ang-2 0.73±0.21 0.79±0.20 0.74±0.11 0.91±0.12 0.81±0.26 Tie-2 0.36±0.12**0.74±0.15##0.59±0.10#0.66±0.14##0.65±0.18##

3.5 補腎活血導法對各組大鼠子宮組織Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA的表達影響

圖3 各組干預后Ang-1、Ang-2、Tie-2 Western Blot分析結果

圖4 Ang-1、Ang-2、Tie-2熒光定量PCR擴增曲線、溶解曲線圖

圖5 各組干預后Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA表達

由圖4、圖5 和表5 可見，模型組大鼠Ang-1、Tie-2 mRNA 表達水平均較空白組顯著降低（P < 0.01），Ang-2 mRNA 表達也較高（P < 0.05）；給藥高、低劑量組和阿司匹林組大鼠Ang-1、Tie-2 mRNA 表達水平較模型組均顯著升高（P < 0.01），且給藥高劑量組Ang-1、Tie-2 mRNA 表達水平與空白組間無統計學差異（P > 0.05）。研究結果表明，補腎活血方能提高模型大鼠子宮組織Ang-1、Tie-2 mRNA表達水平。

3.6 Ang/Tie-2 通路與VEGF、螺旋動脈數量相關性分析

從表6 可見，Ang-1、Tie-2 表達與VEGF 表達呈正相關，r>0.5（P<0.01）；Ang-1、Tie-2 表達與螺旋動脈數量呈正相關，r>0.5（P<0.01）。

表5 各組干預后Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA表達（Realtime PCR，±s）

表5 各組干預后Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA表達（Realtime PCR，±s）

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

組別模型組空白組低劑量組高劑量組阿司匹林組n 6 6 6 6 6 mRNA表達水平（△ct值）Ang-1 29.24±0.72**32.11±0.78##30.96±1.20*##31.17±0.59##31.03±0.91*##Tie-2 25.71±0.18**28.40±1.21##27.47±1.05#28.85±0.42##28.07±1.97##Ang-2 29.23±1.14*27.16±0.67#28.35±0.78 28.06±1.05 29.19±2.82*

表6 Ang/Tie-2通路與VEGF、螺旋動脈數量相關性分析

4 討論

中醫學認為，“腎”在生殖中發揮著重要的作用，腎精是卵子生長發育和成熟的物質基礎。如《素問·上古天真論》就謂：“腎氣盛……天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子。”腎陽虧虛，不能鼓舞腎陰的生化和滋長，同樣也無法使卵子發育成熟。“女子以血為本”，腎氣虧虛，無力推動血液運行，則氣虛血瘀；若腎陽虧虛，血脈失于溫煦，則寒凝血瘀；腎陰不足，虛熱內生，煎灼津液，則熱灼血瘀。血瘀既是腎虛病理產物，同時又可導致或加重腎虛，二者互為因果。可見，腎虛為本，血瘀為標，腎虛血瘀是不孕癥主要發病機制。

導法是將藥物經肛門塞入或腸道灌入以治療疾病的一種傳統給藥方法，在不孕癥治療中有其獨特優勢。首先，胞宮（子宮和附件）位置與直腸相鄰，導法給藥可使藥物直接作用于胞宮和沖任；其次，藥物溫熱不燙時使用可起到溫通血脈的作用；同時“肺與大腸相表里”，藥物可經“肺朝百脈”的作用輸布于全身[15]。另外，現代研究表明，直腸周圍有豐富的動靜脈和淋巴叢，藥物經直腸粘膜吸收，可迅速到達盆腔，進入體循環，避免肝臟“首過消除效應”，藥物吸收和利用度高[16]。據此，曾倩教授針對腎虛血瘀證是女性不孕癥的主要臨床癥型，自擬補腎活血方經導法給藥治療腎虛血瘀型不孕癥，臨床療效較好[8]。補腎活血方由大菟絲子、枸杞子、覆盆子、續斷、絲瓜絡、山楂、丹參、山藥八味藥組成。菟絲子陰陽并補，溫而不燥，補而不滯，繞于豆根之間，吸取它物之精華以自養，取類比象，與胚胎居于母體，吸取母體之精華而存活相類似；植物的種子具有繁殖的特性，故取枸杞子補益肝腎，平調氣血陰陽，滋陰助陽；覆盆子甘平入腎，滋養腎中真陰，益精氣而堅腎氣；續斷補肝腎、調沖任，通行百脈，續血脈而調氣血；丹參行血破淤而生新；絲瓜絡通經活絡、山楂行氣散瘀、山藥平補三陰，三者皆可入胃，而沖脈隸屬于陽明，有從陽明治沖任之意，且傅青主認為山藥可專補任脈之虛。諸藥合用，共奏補腎活血之功效。

本實驗結果表明，補腎活血方導法給藥，可改善腎虛血瘀-胚胎著床障礙模型大鼠種植窗期子宮內膜形態組織學特征，促進螺旋小動脈增生、腺體數量增多，以及增加大鼠子宮濕重和子宮臟器指數，促進其VEGF、FLK-1 表達，并提高其子宮組織Ang-1、Tie-2 mRNA 及蛋白表達水平，并有上調Ang-2 表達水平的趨勢。現代生殖醫學研究表明，種植窗期是子宮內膜允許胚胎著床的關鍵時期，胚胎植入過程伴隨子宮豐富血管組織的生成[2]，血管組織為胚胎附著和著床提供必需的物質，是確保胚胎種植成功的關鍵[3,15-16]。而Ang/Tie-2 信號通路是血管生成的主要通路之一，在Ang/Tie-2 信號通路中，Ang-1 促進血管出芽及分支并維持新生血管完整和穩定，Ang-2降低血管穩定性，增加血管可塑性，二者競爭性結合受體Tie-2 發揮其作用。當VEGF 存在時，Ang-2 的表達使激活的內皮細胞在VEGF作用下增殖、侵襲、遷移，形成新生血管；當VEGF 不存在時，Ang-2 的表達使血管發生退行性變，甚至壞死[19]。

因此，補腎活血方經導法給藥治療腎虛血瘀型不孕癥的助孕機制，可能是通過提高子宮組織VEGF、FLK-1、Ang-1、Tie-2 表達水平，維持Ang-2 正常表達水平，從而促進子宮組織血管新生，并維持新生血管穩定，促進新生血管成熟，促進子宮內膜螺旋動脈增生，增加子宮組織血液灌注，以及促進子宮內膜正常發育，提高子宮內膜容受性，促進胚胎著床。