伊貝母異甾體生物堿通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑機(jī)制的研究＊

焦豪妍，劉 瑤，薛 雪，湯慶發(fā)

（1. 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院 廣州 510520；2. 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 廣州 510515；3. 廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510515）

在世界范圍內(nèi)，支氣管哮喘（哮喘）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的呼吸系統(tǒng)疾病，是由多種炎癥細(xì)胞及其組分參與的慢性氣道疾病。氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度與病情輕重程度密切相關(guān)[1]。氣道重塑是支氣管哮喘的特征性病理改變[2]，主要是指氣道壁結(jié)構(gòu)的改變，包括氣道壁增厚、上皮下基底膜增厚、纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）增生肥大等，上述結(jié)構(gòu)的變化會(huì)引起氣道阻塞，嚴(yán)重時(shí)將危及患者的生命[3]。

目前，臨床上通常給予哮喘患者糖皮質(zhì)激素、支氣管擴(kuò)張劑等藥物進(jìn)行治療，這些藥物短期內(nèi)雖能緩解哮喘癥狀，但難以根治、易復(fù)發(fā)，而且對(duì)氣道重塑的治療作用不顯著[4]。由于缺乏有效的治療藥物，氣道重塑成為哮喘治療中最棘手的問(wèn)題之一。

傳統(tǒng)中藥治療咳喘病經(jīng)驗(yàn)豐富、具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)且安全性高。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找和開(kāi)發(fā)安全有效的哮喘治療藥物具有重要的臨床意義。伊貝母為百合科植物新疆貝母Fritillaria walujewii Regel 或伊犁貝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鱗莖，為藥用貝母之一，具有清熱潤(rùn)肺、化痰、止咳、平喘之功效，臨床主要用于咳喘病的治療[5-6]。近年來(lái)，由于貝母中發(fā)揮止咳平喘藥效的主要活性成分為異甾體生物堿，而伊貝母所含異甾體生物堿的總量在同類貝母中相對(duì)較高[7-9]，這使得貝母倍受關(guān)注。

異甾體生物堿可通過(guò)作用于氣管壁M 受體舒張氣管、降低氣道高反應(yīng)性，從而起到平喘的作用[10]，但是其對(duì)氣道炎癥和氣道重塑的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制并不明確。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中非常重要的一條信號(hào)通路，有研究表明，該通路與氣道炎癥和氣道重塑有著密切的關(guān)系[11]。因此，本論文采用卵清蛋白（OVA）致敏和激發(fā)的大鼠哮喘模型，首次研究伊貝母異甾體生物堿對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的調(diào)節(jié)作用，并基于Wnt/β-catenin 信號(hào)通路探討其可能的作用機(jī)制，為伊貝母藥材的深入開(kāi)發(fā)和使用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

BP211D 電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司），YLS-8A 誘咳引喘儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)設(shè)備站），HC-3018R 高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器公司），GC03 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司），Thermo FC 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），JB-P5 石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司），RM2016 切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司），KD-P 組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），ECLIPSE CI 正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康），DS-U3 成像系統(tǒng)（日本尼康）。

1.2 藥物及試劑

伊貝母藥材購(gòu)自廣州東方大藥房，經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院劉曉春教授鑒定為百合科植物伊犁貝母Fritillaria pallidiflora Schrenk 的干燥鱗莖；OVA（北京百靈威科技有限公司，純度98%）；氫氧化鋁（廣州化學(xué)試劑廠，分析純）；大鼠白介素4（IL-4）、白介素5（IL-5）和 白 介 素13（IL-13）的 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 法（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 抗體（上海瑞齊生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 雄性大鼠40 只，體重為200-250 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041，購(gòu)買(mǎi)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.4 樣品的制備

取伊貝母粉適量置于圓底燒瓶中，加入95%乙醇500 ml，放置于80℃恒溫水浴鍋中回流提取6h，提取3次，抽濾，合并濾液，減壓回收乙醇得稠浸膏，加入蒸餾水懸浮浸膏，加入1 mol·L-1NaOH 調(diào)至pH10，然后用乙酸乙酯多次萃取，萃取液合并，后真空濃縮得到異甾體生物堿浸膏。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠哮喘模型的建立及給藥

將40 只SD 大鼠隨機(jī)分為四組，即健康組、哮喘組、陽(yáng)性藥組（地塞米松）和異甾體生物堿組，每組10只。除健康組外，其余各組分別于第0 天、第7 天和第14天，麻醉下在足跖、兩側(cè)腹股溝、腰、背、胸部等共取10 點(diǎn)，每點(diǎn)皮下注射OVA 和氫氧化鋁混懸液致敏，同時(shí)腹腔注射混懸液。第15 天開(kāi)始，除健康組外，每組大鼠早晨霧化吸入OVA 30 min，健康組用等體積生理鹽水替代，進(jìn)行哮喘大鼠模型的激發(fā)，霧化持續(xù)7 天，同時(shí)各組與霧化前30 min 給予相應(yīng)的藥物：陽(yáng)性藥組灌胃給予地塞米松片0.5 g·kg-1，異甾體生物堿組灌胃給予異甾體生物堿浸膏70 mg·kg-1，健康組及哮喘組灌胃給予生理鹽水。

2.2 樣本的采集及指標(biāo)的檢測(cè)

標(biāo)本的采集：末次激發(fā)2 h 后麻醉大鼠，打開(kāi)胸腔結(jié)扎右支氣管，從氣管插管處用生理鹽水進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，來(lái)回沖洗3 次，合并收集肺泡灌洗液（BALF）。切取未經(jīng)灌洗的大鼠肺組織，采用4%多聚甲醛預(yù)先固定，石蠟包埋，切片，用常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，其余肺組織液氮保存用于Western blot檢測(cè)。

BALF 中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：吸取1.5 mL BALF 于全自動(dòng)五分類動(dòng)物分析儀，進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)包括白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目。

BALF 中細(xì)胞因子IL-4、IL-5 和IL-13 的檢測(cè)：采用ELISA 測(cè)定各樣本IL-4、IL-5和IL-13的水平，測(cè)定過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

支氣管壁和平滑肌厚度：將制作好的肺組織切片置于400 倍光學(xué)顯微鏡下，觀察各組大鼠肺組織的變化和支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度，應(yīng)用圖像分析軟件測(cè)量肺組織支氣管基膜周徑（Pbm），支氣管壁厚度（Wat）= [支氣管總厚度（Wat1）- 管腔厚度（Wat2）]/Pbm，平滑肌厚度（Wam）= [平滑肌外緣內(nèi)氣管厚度（Wam1）-平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管厚度（Wam2）]/Pbm。

Western blot 法測(cè)定肺組織中Wnt5a、Wnt7b 和βcatenin 蛋白含量變化：肺組織樣品加入裂解液，于冰上裂解后離心收集上清。采用蛋白濃度檢測(cè)法檢測(cè)肺組織蛋白上清液中Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 的蛋白含量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目標(biāo)蛋白條帶，隨后將上述目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，采用脫脂奶粉封閉后分別用Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 抗體孵育過(guò)夜，繼而二抗室溫孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影成像。結(jié)果用ImageJ2 軟件分析測(cè)定Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 條帶的積分光密度值的峰面積，分析蛋白的含量變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

各組數(shù)據(jù)均以平均值± S 表示，采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，比較各組間的差異，P<0.05 時(shí)有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 BALF中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

各組計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖1，與健康組比較，哮喘組中的白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯著增加（P < 0.01），符合支氣管哮喘的病理特征。陽(yáng)性藥和異甾體生物堿組均能夠顯著降低白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目，這表明伊貝母中的異甾體生物堿具有良好的抗炎作用。

3.2 BALF中細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的檢測(cè)

各組測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2，與健康對(duì)照組比較，模型組大鼠BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13 的水平顯著升高，與健康組比較，有顯著差異（P<0.01）。給予藥物后，陽(yáng)性藥物和異甾體生物堿組均顯示出調(diào)節(jié)作用（P <0.05），但是陽(yáng)性藥物組的調(diào)節(jié)作用更顯著。

3.3 組織病理學(xué)檢查

圖1 各組BALF白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果（±s,n = 10）

圖2 各組BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平測(cè)定結(jié)果（n = 10）

圖3 各組動(dòng)物肺組織病理學(xué)典型切片

在顯微鏡下觀察大鼠HE 染色結(jié)果，各組典型切片見(jiàn)圖3，健康組肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；哮喘組呈現(xiàn)顯著的支氣管管腔狹窄現(xiàn)象，且支氣管壁厚度和平滑肌厚度均顯著增加，肺泡間質(zhì)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；陽(yáng)性藥組和伊貝母異甾體生物堿組與哮喘組比較，炎癥浸潤(rùn)和氣道重塑現(xiàn)象均明顯改善。

3.4 支氣管壁和平滑肌厚度測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果如圖4所示，與健康組比較，哮喘組支氣管壁和平滑肌厚度均顯著升高（P < 0.01），顯示出氣道重塑的病理特征。給予陽(yáng)性藥物和伊貝母異甾體生物堿后，兩者均顯著降低，且與哮喘組比較，有統(tǒng)計(jì)差異（P < 0.05），說(shuō)明伊貝母異甾體生物堿能干預(yù)氣道重塑。

3.5 Western blot測(cè)定結(jié)果

Western blot 分 析 肺 組 織 中Wnt5a、Wnt7b 和βcatenin蛋白表達(dá)和含量變化結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6，與健康組比較，哮喘組肺組織中Wnt5a、Wnt7b和β-catenin 的蛋白含量顯著增高，提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號(hào)通路在支氣管哮喘大鼠模型中被異常激活，而給予伊貝母異甾體生物堿后，Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 均顯著降低，與模型組比較，有顯著差異，提示藥物可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路干預(yù)氣道炎癥和氣道重塑。

4 討論

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與哮喘氣道炎癥密切相關(guān)。哮喘被認(rèn)為是一種與激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)有關(guān)的疾病，其最顯著的表現(xiàn)是Th2 細(xì)胞依賴性促進(jìn)免疫球蛋白的產(chǎn)生和肥大細(xì)胞的募集；同時(shí)，哮喘的特征還表現(xiàn)為先天性免疫反應(yīng)，影響樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的激活和轉(zhuǎn)運(yùn)，產(chǎn)生先天性免疫細(xì)胞因子，以及淋巴細(xì)胞的啟動(dòng)[12]，上述兩個(gè)過(guò)程均和Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。

在對(duì)哮喘患者外周血單核細(xì)胞（PBMCs）分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著IL?4、IL?5、IL?13水平的增高，Wnt5a的表達(dá)也顯著增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)抗IL?13 單抗可以完全阻止Wnt5a的表達(dá)[13]。有研究表明，Wnt5a與氣道平滑肌（ASM）收縮有關(guān)，而ASM 密切參與調(diào)節(jié)氣道炎癥，因此Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與氣道炎癥特別是過(guò)敏反應(yīng)密切相關(guān)[14]。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與哮喘氣道重塑也密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，β-catenin在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及穩(wěn)態(tài)的維持中具有重要作用，支氣管過(guò)度收縮或拉伸可以激活β-catenin，并使其在氣道上皮以細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)生產(chǎn)等方式參與組織修復(fù)、促纖維化以及哮喘氣道重塑。此外，有研究[16-17]指出，βcatenin 參與氣ASMC 的有絲分裂過(guò)程，其可在ASMC核內(nèi)聚集和轉(zhuǎn)移，對(duì)ASMC 的生長(zhǎng)具有重要的維持作用。因此，β-catenin 的激活是產(chǎn)生氣道重塑的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。

圖4 各組對(duì)支氣管哮喘大鼠支氣管壁厚度及平滑肌厚度的影響（±s,n = 8）

圖5 各組大鼠肺組織中Wnt5a、Wnt7b和β-catenin蛋白表達(dá)

圖6 大鼠肺組織Wnt5a、Wnt7b和β-catenin蛋白的含量變化（±s,n = 8）

Wnt7b 是Wnt 信號(hào)通路配體之一，主要在肺組織上皮表達(dá)，在胚胎時(shí)期便參與肺的發(fā)育和維持血管平滑肌的完整[18]。有報(bào)道指出[19-20]，Wnt7b 能夠調(diào)控肺部平滑肌細(xì)胞的發(fā)育，其表達(dá)失衡與氣道重塑密切相關(guān)。Wnt5a 是ASMC 產(chǎn)生的最主要的Wnt 信號(hào)通路配體，哮喘患者ASMC 中Wnt5a 的表達(dá)與正常人群相比明顯增加；Wnt5a 通過(guò)自分泌信號(hào)促進(jìn)ASMC 中肌動(dòng)蛋白的聚合，肌動(dòng)蛋白的聚合使ASMC收縮力增加，加重了氣道重塑［21-22］。

本研究顯示，與模型組比較，伊貝母異甾體生物堿組大鼠BALF 中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目均顯著降低，BALF 中炎癥因子IL-4、IL-5和IL-13的濃度也顯著降低，組織病理學(xué)檢查顯示肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，上述結(jié)果說(shuō)明伊貝母異甾體生物堿對(duì)哮喘氣道炎癥有抑制作用。同時(shí)，異甾體生物堿組大鼠支氣管管腔狹窄顯著改善，支氣管壁厚度和平滑肌厚度均明顯降低，這說(shuō)明異甾體生物堿對(duì)哮喘氣道重塑也有抑制作用；Western blot 測(cè)定結(jié)果顯示，異甾體生物堿對(duì)哮喘大鼠Wnt/βcatenin 通路上的Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 蛋白表達(dá)有顯著的調(diào)節(jié)作用。據(jù)此，本研究推測(cè)伊貝母異甾體生物堿可能是通過(guò)抑制Wnt5a 或者Wnt7b 的蛋白表達(dá)，從而抑制β-catenin 激活，進(jìn)而阻止了哮喘氣道炎癥和氣道重塑的發(fā)生發(fā)展。伊貝母異甾體生物堿對(duì)哮喘的治療作用與Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)。