基于Akt/ERK探討丹蔞片對主動脈平滑肌細胞增殖、遷移和凋亡的影響＊

司春嬰，王 賀，孫文博，劉俊呈，陳玉善，解金紅，關懷敏＊＊

（1. 河南中醫藥大學第一臨床醫學院 鄭州 450000；2. 河南中醫藥大學第一附屬醫院心臟中心 鄭州 450000）

《中國心血管病報告2018》[1]數據顯示，目前我國冠心病死亡率仍呈上升趨勢，防治仍然刻不容緩。經皮冠脈介入治療（percutaneous transluminal coronary intervention，PCI）是目前冠心病首要治療方式，但術后仍有10%-30% 支架內再狹窄（in-stent re-stenosis，IRS）發生率，導致手術失敗。其原因多與血栓形成、炎癥反應、內皮受損、中膜平滑肌細胞過度增殖、內皮祖細胞的分化遷移、支架斷裂或貼壁不良等[2-3]。其中冠脈血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的過度增殖、異常遷移和凋亡受阻引起大量細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成和血管壁脂質沉積是冠心病PCI 術后IRS 的首要原因[4]。因此，抑制VSMC 過度增殖、遷移，促進其凋亡，是預防IRS 的關鍵所在。目前，現代醫學對IRS 的防治主要有支架治療、基因治療、血管內放射治療和口服藥物治療等幾個方面，但治療效果不盡如人意，仍有部分病人反復發生IRS，使得現代醫學對IRS的防治遇到瓶頸。中醫藥認為，PCI術后IRS仍屬“胸痹”“真心痛”范疇，“本虛標實”仍為其基本病機，“痰瘀”仍為其主要證型，“化痰活血”為其主要治則。因此，本研究通過建立Hcy 誘導兔主動脈平滑肌細胞增殖的離體模型，觀察“化痰活血”代表藥物丹蔞片對兔主動脈平滑肌細胞增殖、遷移及其凋亡的作用，并探討其可能的分子生物學機制，從而為臨床防治冠心病PCI 術后IRS 提供理論依據及新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及藥品試劑

本實驗用大兔原代主動脈平滑肌細胞（RASMC），購置于武漢原生原代（PriCells）生物醫藥科技有限公司（貨號：RAB-CELL-0011）。本研究所用藥品為吉林康乃爾藥業有限公司生產的丹蔞片原粉和阿斯利康制藥有限公司生產的瑞舒伐他汀鈣片（商品名：可定；批號：124862）。研究所需Cell Titer-GloTM購于美國Promega公司（批號：G7570），同型半胱氨酸（Hcy）購于Sigma 公司（批號：69453，純度≥98%），p-Akt 抗體、p-ERK 抗體、β-actin 抗體及二抗均購于Cell Signaling Technology公司，研究用FBS、DMEM培養基、胰酶購于美 國GIBCO 公 司，Transwell 共 培 養 體 系（Corning公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與傳代

RASMC 由Pricell 公司提供，倒置相差顯微鏡觀察，培養的細胞多數呈長梭形，核大，DAPI染色細胞核呈藍色，細胞質呈現綠色，可見明顯的肌絲纖維。經IHC 鑒定，胞漿內α-SMA 陽性表達率超過98%，可確定為RASMC。細胞培養箱參數設為37℃、5%CO2濃度，于該環境下孵育RASMC，每日生長情況于倒置顯微鏡下進行觀察并及時換液，待RASMC 生長至70%-80%培養瓶底時進行傳代，取第3-6 代細胞行后續實驗。

1.2.2 含藥血清制備

雄性健康新西蘭大白兔12只（購置于山東魯抗醫藥股份有限公司，批號SCXK 魯20130001），體重3.0±0.5 kg，適應性喂養1 周后隨機分4 組：空白組、丹蔞片組、瑞舒伐他?。啥ǎ┙M和丹蔞片聯合瑞舒伐他?。ɑ旌希┙M，每組3只。按人臨床用藥等效劑量，以體表面積換算公式進行換算，后三組分別灌胃丹蔞片原粉、可定及丹蔞片原粉聯合可定，空白組灌胃等體積生理鹽水，每天灌胃1次，連續5天，各組于末次灌胃3小時后腹主動脈采血，離心并滅活后置于-80℃冰箱凍存備用。

1.2.3 細胞分組及藥物干預

取生長狀態良好的RASMC 細胞胰酶消化，制備單細胞懸液，分別調整細胞濃度為1×104/mL，1×105/mL 和2 × 105/mL，分別種于96 孔板（每孔200 μL）、Transwell 上室（每孔200μL）和6 孔板（每孔1 mL）中，繼續培養12 h 待所有細胞完全貼壁，無血清同步化24 h 后，將細胞分為空白組、Hcy 組、丹蔞片組、瑞舒伐他?。啥ǎ┙M、丹蔞片聯合瑞舒伐他?。ɑ旌希┙M。除空白組外，其余各組均加入濃度為10-4mol/L Hcy；同時，后三組分別加入相應含藥血清，培養24 h 后收集細胞。

1.2.4 Cell Titer-Glo法測細胞增殖

從細胞培養箱中取出96孔板，吸取各組上層細胞培養液，每孔加入工作液50 μL，震蕩1-2 min 使細胞完全裂解。于室溫避光放置10 min，待光信號穩定后，上機讀取并記錄光信號強度。

1.2.5 Transwell法測細胞遷移

取孔徑8 μm 的24 孔共培養遷移小室，按上述分組向各組小室加入200μL無血清DMEM 培養基，于細胞溫箱中濕化2 h，棄上層培養基。胰酶消化后完全培養基重懸細胞，調整密度至1×105/mL，于小室上層加入單細胞懸液200μL/孔。空白組小室下層加正常兔血清培養基600μL，Hcy 組小室下層加含Hcy10-4mol/L 的等體積正常兔血清培養基，其余各組在Hcy10-4mol/L 基礎上加等體積相應含藥血清。于溫箱中培養24 h，取上室棄上清，棉簽擦去上室內側細胞，保留下側細胞，PBS 潤洗3 次，于4%多聚甲醛中固定細胞20 min，PBS 潤洗3 次，0.1%結晶紫溶液染色15 min，再用PBS 洗滌3 次后倒置顯微鏡下隨機取5 個視野觀察計數，取其平均值。

1.2.6 流式細胞儀測細胞凋亡率

各組細胞用PBS 洗滌，胰蛋白酶消化后轉移至離心管，加培養液，混勻，1000 r/min離心，棄上清，加PBS重懸細胞，調整細胞濃度為106/mL，取0.5 mL 細胞懸液，1000 r/min 離心4 min，棄上清，加0.5 mL Binding Bufer，重懸細胞，加1μL 熒光標記的Annexin V 試劑，混勻，室溫下避光孵育20 min，加入PI 5 μL，混勻后4℃下避光孵育5 min，加入Binding Bufer 500μL，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.7 Western blot測信號通路蛋白表達

提取各組處理后細胞的總蛋白質，用BCA 法檢測蛋白濃度，以β-actin 作為內參，SDS-PAGE 電泳，轉膜，將膜用TBS 緩沖鹽水從下向上浸濕后，移至含有5%脫脂奶粉的封閉液器皿中，室溫脫色搖床上搖動封閉1 h 后，加入1∶5 000 比例稀釋的一抗，37℃孵育12 h，平盤中加入TBST 放在脫色搖床上洗3 次，每次10 min。同樣，步驟加入二抗，避光、室溫、緩搖床孵育50 min，洗滌后用化學發光成像儀顯影，使用Image J分析條帶灰度值。

1.3 統計學分析

采用SPSS19.0 統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較時行方差齊性檢驗，若方差齊則以one-way ANOVA 的LSD 法檢驗；若方差不齊用Dunnet’T3 法檢驗。兩組間比較采用成組t 檢驗。以P<0.01或P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組RASMC細胞增殖結果比較

與空白組比較，Hcy 組細胞明顯增殖（P < 0.01）；與Hcy 組比較，三個用藥組細胞增殖顯著下降（P <0.01），且混合組細胞增殖明顯低于丹蔞片組和可定組（P < 0.01）；較丹蔞片組，可定組增殖雖有所減少，但差異無統計學意義（P>0.05）（見表1、圖1）。

2.2 各組RASMC細胞遷移結果比較

與空白組比較，Hcy 組RASMC 遷移數明顯增加（P <0.01）；與Hcy 組比較，三個用藥組細胞遷移數顯著減少（P < 0.01），且混合組細胞遷移數明顯低于丹蔞片組和可定組（P<0.01）；與丹蔞片組比較，可定組細胞遷移數明顯減少（P<0.01）（見圖2、圖3）。

表1 各組RASMC細胞增殖活力比較（±s）

表1 各組RASMC細胞增殖活力比較（±s）

注：*與空白組比較，P < 0.01；#與Hcy 組比較，P < 0.01；▽與混合組比較，P<0.01

組別空白組Hcy組丹蔞片組可定組混合組發光強度（RLU）1249415.67±61902.3 1684822.00±59114.14*668649.33±73205.79#▽557238.33±18008.98#▽306976.33±38836.49#

圖1 各組RASMC細胞增殖活力比較

2.3 各組RASMC細胞凋亡率比較

細胞凋亡結果顯示：與空白組比較，Hcy組細胞凋亡明顯減少（P <0.01）；與Hcy 組比較，三個用藥組細胞凋亡明顯增加（P < 0.01），且混合組細胞凋亡顯著高于丹蔞片組和可定組（P<0.01）；與丹蔞片組比較，可定組細胞凋亡明顯增加（P<0.05）（見表2、圖4）。

2.4 各組RASMC細胞信號通路蛋白表達量比較

結果顯示：①各組非磷酸化Akt 蛋白和非磷酸化ERK 蛋白的表達均無明顯變化（P > 0.05）；②p-Akt：與空白組比較，Hcy 組p-Akt 蛋白表達顯著上調（P <0.01）；與Hcy組比較，三個用藥組p-Akt蛋白表達明顯下調（P<0.01），且混合組p-Akt顯著低于丹蔞片組和可定組（P < 0.01）；與丹蔞片組比較，可定組p-Akt 表達進一步減少，但差異無統計學意義（P>0.05）；③p-ERK：與空白組比較，Hcy 組p-ERK 蛋白表達顯著上調（P<0.01）；與Hcy 組比較，三個用藥組p-ERK 蛋白表達明顯下調（P < 0.01），且混合組p-ERK 顯著低于丹蔞片組和可定組（P<0.01）；與丹蔞片組比較，可定組p-ERK 表達雖有所下調，但差異無統計學意義（P>0.05）（見圖5）。

圖2 各組RASMC Transwell小室遷移（×200）

圖3 各組RASMC遷移數目比較

表2 各組VSMC細胞凋亡率比較（±s）

表2 各組VSMC細胞凋亡率比較（±s）

注：*與空白組比，P<0.01；#與Hcy 組比較，P<0.01；▽與混合組比較，P<0.01；?與丹蔞片組比，P<0.05

凋亡率/%13.64±0.33 10.57±0.50*15.08±0.15#▽16.99±0.29#▽?19.96±0.28#組別空白組Hcy組丹蔞片組可定組混合組

3 討論

PCI是目前冠心病主流治療手段，然而PCI術后仍有10%-30%IRS 發生率，這與中膜VSMC 過度增殖及遷移、血栓形成、炎癥反應、內皮受損、內皮祖細胞的分化遷移、支架斷裂或貼壁不良等多種機制有關[2-3]，其中VSMC 的異常遷移、過度增殖和凋亡抑制所引起的大量ECM 合成和血管壁脂質沉積是包括PCI 術后再狹窄在內的所有阻塞性血管疾病首要原因[4-5]。PCI術后，支架作為異物，其置入處血管存在持續炎癥反應，刺激平滑肌細胞由收縮型向分泌型表型轉化，后者進一步釋放大量IL-6、TNF-α等炎癥因子及VEGF、SDF-1等細胞因子，引起VSMC 的過渡增殖、向內膜遷移，合成大量的細胞外基質并吞噬脂質形成肌源性泡沫細胞，加重局部炎癥反應，促進支架內新生動脈粥樣硬化（in stent neoatherosclerosis，ISNA）的發生，加速IRS 的發生和進展。因此，抑制VSMC 過度增殖、遷移，誘導其凋亡，是預防IRS的關鍵所在。目前現代醫學對IRS的防治主要為支架治療、基因治療、血管內放射治療和口服藥物治療等幾個方面，但治療效果不盡如人意，仍有部分病人反復發生IRS，使得現代醫學對IRS 的防治遇到瓶頸。中醫藥理論認為，PCI 術后IRS仍屬“胸痹”“真心痛”范疇，“本虛標實”為其基本病機，PCI治療雖有“破血”功效，但支架作為異物加重血管炎癥反應，血管機械損傷進一步加重，導致“瘀血阻滯，血脈不通，因此“痰瘀”仍為其主要證型，“化痰活血”為其主要治則[6]。

圖4 各組RASMC凋亡率比較

高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，Hhcy）是AS 新的獨立危險因素之一，同時也是急性冠脈綜合癥（ACS）的獨立危險因子[7-10]，作為一種反應性血管損傷氨基酸，Hcy 可促進AS 及血栓形成[11]。研究發現，在冠心病PCI 術后，Hcy 水平較術前無明顯變化，術前Hcy 水平的高低決定PCI 術后早期并發癥的發生率[12-13]。因此，PCI 治療僅改變局部血液供應，Hhcy 導致的全身和支架局部高炎癥反應狀態并未得到糾正。通過本實驗驗證，經Hcy 誘導后，RASMC 過渡增殖、遷移，同時細胞凋亡率下降，凋亡受阻，這與前人研究結果相一致。

既往研究表明，Akt和ERK 信號通路在AS 病變中發揮了重要的作用，Akt 有絲/蘇氨酸激酶活性，可被PI3K 激 活 生 成 磷 酸 化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt），后者貫續激活其下游分子發揮生物學作用。PI3K/Akt 信號通路廣泛參與包括AS 在內的多種心血管疾病形成過程，通過調控VSMC增殖和遷移、血管新生、炎癥反應等過程，促進AS 發生、發展[14]。ERK/MAPK 信號轉導通路廣泛存在于多種細胞內,磷酸化激活后的p-ERK 調節細胞的增殖、分化、遷移等生物學行為[15]。通過本研究證實，在Hcy 誘導的RASMC 過渡增殖和遷移模型中，p-Akt 及p-ERK 蛋白表達量顯著增加，提示p-Akt及p-ERK 可能在Hcy 誘導RASMC增殖、遷移時發揮重要作用。

丹蔞片是“化痰活血”代表藥物，由薤白、瓜蔞皮、葛根、丹參、川芎、赤芍、澤瀉、黃芪、郁金等構成，目前研究表明，其有降脂、抗炎、保護內皮功能、消退AS 斑塊等作用[16-20]，但這些研究多集中在探討丹蔞片對內皮細胞功能調節和對血脂水平調節等方面，而對血管平滑肌細胞作用的研究較少，恰正如前所述后者是干預IRS的核心靶點。因此，通過本實驗研究證實，丹蔞片能夠明顯抑制Hcy 誘導RASMC 增殖和遷移，增加RASMC凋亡率，下調p-Akt和p-ERK信號通路蛋白的表達水平，且與瑞舒伐他汀聯合應用后，其作用進一步增強，提示丹蔞片具有抗RASMC 細胞增殖和遷移，誘導其凋亡的作用，該作用可能是通過下調p-Akt 和p-ERK 信號通路蛋白表達水平實現的。本研究不足之處在于未加入Akt 與ERK 信號通路阻斷劑，需在后續實驗中添加信號通路特異性阻斷劑進一步驗證丹蔞片抗血管平滑肌細胞增殖、遷移，誘導其凋亡的作用機制。

圖5 Western Blot檢測信號通路蛋白表達