UPLC-MS/MS法測定犬血漿中的雷公藤次堿及體內藥動學研究＊

楊 煬，宋小仙，涂如霞，蘭 波，吳思瀾，

莫宗成，羅金萍，張 莉，劉劍毅＊＊

（重慶市中藥研究院 重慶 400065）

雷公藤次堿為雷公藤中常見生物堿，從雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook）.F.（TWHF）根和皮中提取出，是雷公藤根皮中主要生物活性物質，含量較高，具有明顯的體液免疫和細胞免疫抑制作用，被廣泛用作治療廣譜自身免疫性和炎性疾病的中藥，包括類風濕性關節炎，系統性紅斑狼瘡，強直性脊柱炎，牛皮癬和特發性IgA 腎病[1-2]，活性較強且毒性小于雷公藤甲素，越來越受關注[3]。經雷公藤提取上市的雷公藤多苷片成功的應用于臨床多年[4-5]，其治療特征可歸因于兩大類成分：萜類化合物和吡啶生物堿類化合物，萜類包括雷公藤內酯，三萜化物和三萜內酯，吡啶生物堿類包括雷公藤堿、雷公藤次堿、雷公藤春堿等。研究表明雷公藤次堿是雷公藤多苷片的代表性化合物之一[6]。迄今為止，報道了雷公藤甲素、紅素等藥代動力學[7-9]，但吡啶生物堿的藥代動力學信息仍然非常有限，因此有必要對雷公藤次堿進行體內藥代動力學研究。

目前，超高效液相-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）是天然產物分析中最有效的分析技術之一[10]。UPLC 的分離度明顯優于HPLC，其色譜峰擴展很小，峰濃度很高，有利于化合物的離子化，同時有利于與基質雜質的分離，降低基質效應，使靈敏度和重現性大大提高[11]。質譜及質譜聯用對目標化合物進行不同的碎片掃描，可有效識別混合物中的目標化合物，顯著提高信噪比[12]。UPLC-MS/MS 將色譜的高鑒別性能和質譜的高分離特點完美結合，具有高分離能力，高靈敏度，應用范圍廣和專屬性強等特點，符合現代藥物分析研究對高精密度和準確度分析方法的需求[13]，廣泛運用于中藥復雜成分研究及環境分析、藥物分析等領域。本實驗以雷公藤中雷公藤次堿為研究對象，建立了UPLC-MS/MS 法檢測雷公藤次堿的犬血漿濃度，表征了雷公藤次堿的藥代動力學，明確了雷公藤次堿在犬體內作用規律，對雷公藤次堿的臨床使用提供重要參考。

1 實驗材料

1.1 試藥與儀器

雷公藤次堿（北京融誠鑫德科技發展有限公司，純度≥98%；批號：L-053180122），雷公藤春堿（北京融誠鑫德科技發展有限公司，純度≥98%；批號：L-103-171216）；醋酸銨（ACS公司，批號：35Y1402KS）。

高分辨質譜系統（美國AB SCIEX 公司，型號：API 4000）；超高效液相系統（日本島津公司，型號：LC-30AD）；十萬分之一精密電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，型號：XS105DU）；渦旋儀（英國Stuart 公司，型號：SA8）；離心機（美國Beckman Coulter 公司，型號：Microfuge 22R）；超純水凈化系統（美國密理博公司，型號：Elix10）。

1.2 實驗動物

Beagle 犬，普通級，雌性各半，體重7.0-9.0 kg，購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所，生產許可證號：SCXK（渝）2017-0003，動物檢疫及適應性飼養2周。

2 實驗方法

2.1 對照品與供試品溶液的制備

分別精密稱量對照品雷公藤次堿和內標（雷公藤春堿）各10.25 mg、10.17 mg 于100 mL，加乙腈制成102.50 μg·mL-1雷公藤次堿與101.70 μg·mL-1內標儲備液溶液。雷公藤次堿用乙腈系列稀釋為5.13、10.25、25.63、51.25、76.88、102.50、128.13、256.25 ng·mL-1，內標用乙腈稀釋為101.70 ng·mL-1。

含藥血漿對照品的制備：精密吸取50 μL 混合空白血漿于1.5 mL EP 管中，分別精密加入系列濃度雷公藤次堿及100 ng·mL-1內標對照品溶液各10 μL，渦旋 混 勻30 s 后 加 入400 μL 甲 醇，渦 旋 混 勻2 min，12000 rpm 離心15 min，取上清150 μL 于進樣瓶中，2 μL 進樣分析。同法制備低、中、高濃度（10.25、51.25、205.00 ng·mL-1）的質控溶液。

表1 MRM離子對條件

供試品溶液的制備：稱取70 mg HTⅡ于燒杯中，加入適量0.5% CMC-Na 溶液攪拌均勻，定容至175 mL，即得400 μg·mL-1（高劑量）的HTⅡ混懸液；取高劑量混懸液70 mL，加入70 mL 0.5%CMC-Na 溶液，混勻，即得200μg·mL-1（中劑量）的HTⅡ混懸液；取中劑量混懸液50 mL，加入50 mL 0.5% CMC-Na 溶液，混勻，即得100μg·mL-1（低劑量）的HTⅡ混懸液。

2.2 給藥和樣品采集

取Beagle 犬30 只，雌雄各半，分為3 組，每組10只，即高劑量組（400 μg·kg-1）、中劑量組（200 μg·kg-1）、低劑量組（100 μg·kg-1）。將配制好的供試品溶液按1 mL·Kg-1單次灌胃給予，給藥前采集空白血樣，灌胃后于0.5、1、1.5、2、4、6、8、24 h 前臂頭靜脈采血，約取1.5 ml 全血置于入肝素鈉抗凝管中，3000 r·min-1離心10 min，分離血漿，再分為兩管（一管取50μL，剩余血漿放置于另一管，備用），-80℃冷凍保存備用。

2.3 色譜與質譜分析條件[14-15]

液相條件：ACE Super C18柱（2.1×100 mm id，5μm，菲羅門），流動相為2 mM 醋酸銨（0.2 %甲酸）（A）：乙腈（B），梯度洗脫（0-0.5 min，15% B；0.5-1.5 min，15%-90% B；1.5-3.6 min，90% B；3.6-3.7 min，90%-15% B；3.7-5.5 min，15% B），體積流量350 μL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量2μL。

質譜條件：采用ESI-Positive-MRM 模式，霧化氣（Gas1）：55Psi，輔助氣（Gas2）：55 Psi，源噴射電壓（IS）：5500 V，霧化溫度（TEM）：600°C，CAD：4 Psi，氣簾氣（CUR）：15 Psi，質譜條件優化如表1。

2.4 血漿樣品的處理與測定

圖1 雷公藤次堿和雷公藤春堿犬血漿樣品的專屬性色譜圖

采用甲醇除蛋白進行前處理：精密移取50 μL 血漿樣品，精密加入水與100 ng·mL-1內標對照品溶液各10 μL，渦旋混勻30 s 后加入400 μL 甲醇，渦旋混勻2 min，12000 rpm 離心15 min，取上清150 μL 于進樣瓶中，2μL 進樣分析。采用本文中建立的UPLC-MS/MS法測定血漿中雷公藤次堿濃度，DAS3.0分析其主要藥動學參數。

3 實驗結果

3.1 方法專屬性

取對照品儲備液，采用乙腈稀釋，得到102.50 ng·mL-1雷公藤次堿對照品溶液（圖C）與101.70 ng·mL-1內標對照品溶液（圖D）。精密移取50 μL 血漿樣品，分別精密量取乙腈（圖A）、水（圖B）、102.50 ng·mL-1雷公藤次堿（圖E）與101.7 ng·mL-1內標（圖F）對照品溶液各10μL，按“2.4”項下方法進行除蛋白處理后進樣，離子流圖如圖1，結果顯示雷公藤次堿和內標的出峰時間分別為2.99、2.73 min，峰型良好，兩者的分離度好，空白血漿在樣品峰及內標峰處的干擾小，專屬性強，適用于犬體內血漿樣品的測定。

3.2 線性范圍和定量限、檢測限

取對照品儲備液，按“2.1”項下含藥血漿對照品的制備方法，分別制備5.13-256.25 ng·mL-1血漿對照品，取儲備液重復配制3 組。以3 組對照品峰面積與內標峰面積比值的平均值為縱坐標、對照品的濃度為橫坐標，進行線性回歸，計算回歸方程及相關系數，結果見表2，表明雷公藤次堿與內標峰面積比值在5.13-256.25 ng·mL 范圍內標準曲線線性關系良好（r >0.99）。將對照品溶液分別逐步稀釋并進行測定，并以信噪比S/N = 3 和S/N = 10 時各對照品的量作為檢測限（LOD）和定量限（LOQ），結果測得，定量限為4.94 ng·mL-1，檢測限為0.49 ng·mL-1。

表2 線性關系

3.3 基質效應

分別精密吸取5 只Beagle 犬空白血漿各50μL 于EP管中，精密加入純水20μL，渦旋混勻30 s后加入甲醇400 μL，渦旋混勻，12000 rpm 離心15 min，各取上清160 μL 于新的EP 管中，分別精密加入102.50 ng·mL-1的雷公藤次堿及101.70 ng·mL-1內標對照品溶液各20μL，渦旋混勻30 s，進樣分析，得峰面積A。分別精密吸取上述相同濃度的雷公藤次堿及內標對照品溶液各20 μL，加甲醇溶液160 μL，渦旋混勻30 s 后，進樣分析，得峰面積B。以公式B/A×100%計算基質效應，計算血漿樣品的基質效應。雷公藤次堿基質效應分別為80.82%、98.53%、104.46%、115.03%、110.77%，內標基質效應分別為88.64%，100.02%，102.11%，97.10%，91.99%，平均值分別為101.92%、95.97%。表明該檢測方法無明顯離子增強或抑制效應。

3.4 精密度及準確度

取低、中、高濃度（10.25、51.25、205.00 ng·mL-1）的質控溶液，每個濃度重復制備5份，分一天和三天重復測定一批和三批，以當日隨行標曲計算樣品濃度，計算低、中、高濃度質控溶液的一天和三天的批內及批間精密度，結果顯示低中高濃度批內精密度的RSD 分別為6.95%，10.73%，9.66%，批間精密度分別為7.83%，5.40%，3.77%，批內批間精密度均小于15%；低中高濃度平均回收率分別為113.55%、109.43%、91.10%，RSD 分別為12.14%，9.00%，10.83%，平均回收率均在91.10%-113.55%之間，且RSD 均小于15%。表明該方法精密度及準確度良好。

3.5 提取回收率

取低、中、高濃度（10.25、51.25、205.00 ng·mL-1）的質控溶液，另取對應濃度相同的低、中、高3 個濃度的對照品溶液，每個濃度制備5份樣品，每個樣品分析一次，將樣品的檢測信號與未經提取處理的相應濃度的標準溶液的檢測信號比較，得到低中高濃度平均提取回收率分別為：112.76%、82.86%、95.72%，提取回收率在82.86%-112.76%之間。

3.6 穩定性

制備低、中、高濃度雷公藤次堿對照品，每個濃度平行5份，考察處理過程中的室溫放置12 h的穩定性；制備低、中、高濃度雷公藤次堿血漿樣品，每個濃度平行5 份，考察低、中、高濃度含藥血漿樣品除蛋白處理前室溫放置12 h 過程的穩定性，考察低、中、高濃度血漿樣品除蛋白處理后樣品盤（4℃）中放置12 h 的穩定性，考察低、中、高濃度樣品反復凍融三次的穩定性，考察低、中、高濃度血漿樣品低溫（-80℃）長期放置（10 天）的穩定性，結果見表3，顯示中、高濃度RSD 均小于15%，低濃度RSD 均小于20%，表明雷公藤次堿各穩定性均符合要求。

3.7 雷公藤次堿在Beagle犬體內的藥動學研究

雷公藤次堿高、中、低劑量組給藥后，采集各時間點血漿，按“2.4”與“2.3”項下方法處理與測定后，得到犬血漿藥時曲線見圖2；將測得的血藥濃度-時間數據采用DAS 3.0 軟件處理，雷公藤次堿的藥動學參數見表4；藥動學參數與劑量和性別比較后結果見表5。由表可知：Tmax 均在1.1h 左右；高劑量組雄犬、雌犬的AUC（0-24h）為低劑量組的1.84、4.85 倍；中劑量組雄犬、雌犬的AUC（0-24h）為低劑量組的1.40、1.37倍；高劑量組雄犬、雌犬的Cmax為低劑量組的1.99、6.67倍；中劑量組雄犬、雌犬Cmax 為低劑量組的1.17、1.73 倍；而高、中、低劑量組的劑量比為4∶2∶1，表明雷公藤次堿吸收較快，在Beagle 犬體內的系統暴露隨劑量的增大而增加，有呈比例增加的趨勢。中低劑量組的AUC（0-24h）與Cmax 的雄雌比分別為1.06、1.03、0.98、1.44倍，而高劑量組的AUC（0-24h）與Cmax 的雄犬/雌犬分別為0.39、0.43，表明除高劑量組給藥后雷公藤次堿在雄性Beagle 犬體內的暴露明顯小于雌性外，其余劑量組給藥后雷公藤次堿在雄性Beagle犬和雌性Beagle犬體內的系統暴露未見明顯差異。

表3 雷公藤次堿穩定性試驗結果（ng·mL-1，±SD，n = 5）

表3 雷公藤次堿穩定性試驗結果（ng·mL-1，±SD，n = 5）

考察狀態0 h對照品室溫放置12 h樣品處理前室溫放置12 h樣品處理后樣品盤放置12 h樣品低溫放置10天反復凍融穩定性3次理論濃度10 50 200 10 50 200 10 50 200 10 50 200 10 50 200 10 50 200檢測濃度9.07±1.05 50.27±5.47 188.06±16.08 9.22±0.95 47.05±3.21 188.44±10.24 9.93±1.28 46.96±2.64 189.12±15.32 8.76±1.40 50.21±0.67 191.41±16.24 8.99±1.01 47.29±6.15 199.76±10.54 10.46±1.14 47.46±3.24 195.21±14.34 RSD%11.56 10.87 8.55 14.71 7.23 8.40 18.84 10.48 10.81 16.76 5.09 3.54 15.83 9.11 7.84 18.34 10.15 10.18

雄性t1/2z的高中低劑量組均保持在8.5 h 左右，雌性t1/2z的高中低劑量組均保持在5.1 h 左右；雌犬高中低劑量的CLz/F基本無差異，而雄犬的CLz/F隨劑量增大有所增加；表明雷公藤次堿的消除與劑量無關，與性別有關。

4 討論

4.1 血漿樣品前處理及色譜條件優化

本研究比較了比較了甲醇、乙腈除蛋白效果，發現甲醇除蛋白后回收率高，且基本無基質效應，故選擇甲醇作為蛋白沉淀試劑；甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-甲酸銨甲酸水以及乙腈-乙酸銨甲酸水等流動相，發現雷公藤次堿在乙腈-甲酸銨甲酸水條件下響應最高，且拖尾影響最小，因此選擇乙腈-2 mM醋酸銨含0.2%甲酸水作為流動相。

4.2 劑量設定

圖2 雷公藤次堿血藥濃度-時間曲線（±SD，n = 5）

表4 雷公藤次堿在犬血漿中的主要藥動學參數（±SD，n = 5）

表4 雷公藤次堿在犬血漿中的主要藥動學參數（±SD，n = 5）

注：*為與雄性比較，P<0.05

CLz/F/(L kg-1 h-1)1.78±0.57 0.59±0.43*0.96±0.46 0.63±0.58 0.71±0.35 0.64±0.17組別高劑量組性別中劑量組低劑量組雄雌雄雌雄雌Tmax/h 1.00±0.35 1.30±0.27 1.00±0.41 1.10±0.42 1.10±0.42 1.30±0.45 AUC(0-24 h)/(μg L-1*h)302.5±87.6 772.6±156.6*230.6±104.8 217.9±70.5 164.4±42.6 159.2±48.2 Cmax/(μg L-1)69.3±14.3 161.8±39.8 41.0±15.1 42.0±17.8 34.9±12.7 24.3±8.7 t1/2z/h 8.84±1.41 4.92±1.62 8.69±2.23 4.70±1.42 8.01±1.19 5.88±0.93

表5 雷公藤次堿在犬血漿中藥動學參數組別與性別比值分析

雷公藤次堿為雷公藤多苷片的主要成分之一，在雷公藤多苷片中含量約為20 μg·mg-1, 雷公藤多苷片臨床人用劑量最大為1.5 mg·kg-1，折算成犬的等效劑量約為3 mg/Kg，其中雷公藤次堿劑量約為60μg·kg-1。現報道雷公藤多苷大鼠的生殖毒性[16]、血液系統毒性[17]及肝毒性劑量[18-19]，在94.5-150 mg·kg-1劑量范圍內，折算成雷公藤次堿犬的劑量為529-840 μg·kg-1。綜合文獻雷公藤多苷片在犬血漿中藥代動力學研究[20]、雷公藤免疫抑制藥效[21]、毒性劑量及根據新藥非臨床藥代動力學研究試驗設計原則，設計了本文Beagle犬給藥劑量。

4.3 藥動學

藥動學結果顯示高劑量組不同性別的Cmax、AUC(0-24h)差異較大，因此我們選擇將雌雄分開統計。其AUC、Cmax 等隨給藥劑量的增加而增大，有呈比例增長的趨勢，且其t1/2、CLz/F 與劑量無關，雷公藤次堿在Beagle 犬體內的藥動學過程應屬于線性動力學過程，但高劑量組雄性產生明顯差異，可能由以下幾個方面導致：1.雌雄對雷公藤次堿的消除有差異；2.隨著給藥劑量的增大，雷公藤次堿對犬產生了毒性反應；3.在給藥過程中，或樣品前處理過程中帶來了誤差，導致樣品測定結果產生誤差，導致血藥濃度和用藥劑量不成比例關系。清除率（CLz/F）變大會導致血藥濃度以及Cmax降低[22]，與雌性比較，高劑量組雄性的CLz/F變大后，AUC 和Cmax 確有不同程度的降低，說明高劑量不僅影響了代謝及排泄，且對吸收也產生了影響。根據文獻報道雷公藤生物堿類物質可損傷肝細胞、破壞紅細胞、引起進行性貧血[23]，雷公藤具有胃腸毒性及腎毒性，而雷公藤次堿的胃腸毒性及腎毒性未見報道。后期可采用長期給藥毒代動力學試驗進行驗證。本研究雷公藤次堿在犬體內藥動學特征與文獻中報道[20]的基本一致。

本研究建立了一種準確，靈敏，快速的LC-MS/MS方法，該方法的開發和驗證成功應用于測定Beagle 犬血漿中的雷公藤次堿靈敏度高，響應線性好，精密度和準確度高。在Beagle 犬中首次單獨給予雷公藤次堿并對其藥動學特征進行了評價，為雷公藤次堿的藥代動學及毒代動力學研究提供設計依據。